用于制備臨床樣品的技術(shù)已經(jīng)完善，可用于多種臨床情況下的診斷測試，例如，提取，濃縮和純化呼吸道病毒顆粒。這些技術(shù)可提供高純度和高濃度的目標(biāo)樣品，但需要大量設(shè)備和訓(xùn)練有素的人員來進(jìn)行，而在資源有限的環(huán)境中很難實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，而快速檢測和診斷對于正確處理呼吸道病毒至關(guān)重要。微流體已廣泛用于資源受限的環(huán)境中的快速病毒檢測，在這種環(huán)境中，大多數(shù)設(shè)備都專注于檢測而不是樣品制備。最初的微流體原型由于它們依賴于幾個(gè)片外預(yù)處理步驟和外部實(shí)驗(yàn)室設(shè)備而受到阻礙。最近，樣品制備方法也已被并入微流控技術(shù)中，以多合一的自動(dòng)化方式進(jìn)行病毒檢測。在較小體積的樣品和試劑中已證明了病毒的提取，濃縮和純化，不需要專門的培訓(xùn)或復(fù)雜的設(shè)備。最近的設(shè)備顯示出能夠獨(dú)立有效地運(yùn)行以提供快速，自動(dòng)化的樣品制備以及高效檢測病毒樣品的能力。在這篇綜述中，討論了用于分離和純化病毒樣品的微流體樣品制備方法，總結(jié)了當(dāng)前系統(tǒng)的局限性，并確定了潛在的進(jìn)展。在更少量的樣品和試劑中，病毒的濃縮和純化已得到證明，不需要專門的培訓(xùn)或復(fù)雜的設(shè)備。最近的設(shè)備顯示出能夠獨(dú)立有效地運(yùn)行以提供快速，自動(dòng)化的樣品制備以及高效檢測病毒樣品的能力。

介紹

呼吸道病毒遍布全球，感染人類的上呼吸道和下呼吸道，導(dǎo)致呼吸窘迫，，尤其是在兒童和老年人中。這些病毒的流行可以保持持久或季節(jié)性變化?？傮w而言，這些呼吸道病毒持續(xù)具有在全球范圍內(nèi)傳播的潛力，如先前的暴發(fā)[2009 H1N1，嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥（SARS）和中東呼吸綜合癥（MERS）]以及目前的2019年冠狀病毒?。–OVID- 19）大流行。對這些病毒的顯著緩解、管理和治療在很大程度上依賴于快速識(shí)別高危人群并測試感興趣的生物樣本中是否存在病毒的能力。通常，在沒有實(shí)驗(yàn)室設(shè)備或訓(xùn)練有素的人員的情況下，在資源有限的環(huán)境中可以對這些樣品進(jìn)行快速而靈敏的檢測。必須對這些生物學(xué)和臨床樣品進(jìn)行處理，以產(chǎn)生高純度的濃縮病毒。生物樣品的收集方法以及所需的樣品存儲(chǔ)和處理步驟根據(jù)要檢測的病毒和最適合檢測病毒的樣品基質(zhì)而有所不同。

呼吸道病毒

有大量的呼吸道病毒?？紤]到它們的致突變性和全球流行性，必須測試數(shù)百種血清型。這些病毒通常會(huì)引起呼吸窘迫和發(fā)燒癥狀，并導(dǎo)致發(fā)病，特別是在兒童和老年人中。在人類中最常見的病毒包括呼吸道合胞病毒（RSV），人副流感病毒（HPIV），人間質(zhì)肺病毒（HMPV），人鼻病毒（HRV），冠狀病毒，腺病毒，博卡病毒，腸病毒以及甲型和乙型流感。這些病毒不是唯一存在的呼吸道病毒，但它們涵蓋了臨床相關(guān)呼吸道病毒的最大范圍。特別是2009年H1N1（新型A / H1N1流感；也稱為豬流感），SARS（嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥；由SARS冠狀病毒或SARS-CoV引起），MERS（中東呼吸綜合癥；由MERS-冠狀病毒或MERS引起） -CoV）和最近的COVID-19（2019年冠狀病毒??；由SARS-CoV-2引起）已導(dǎo)致全球大流行，最初都沒有適當(dāng)?shù)闹委熯x擇或疫苗，而快速和低成本的檢測是實(shí)現(xiàn)遏制這一目標(biāo)的關(guān)鍵成功的。

臨床樣本

臨床樣品的生物學(xué)起源和時(shí)間大大影響了病毒的準(zhǔn)確和早期檢測。例如，并非所有病毒最初都會(huì)導(dǎo)致痰液的產(chǎn)生（咳嗽產(chǎn)生的粘液），因此拭子可能是必需的，盡管它們無法像其他采樣方法一樣深，例如吸氣收集（收集樣本）通過真空泵導(dǎo)管系統(tǒng)）。此外，病毒在體內(nèi)整個(gè)孵育過程中，會(huì)在不同時(shí)間在不同區(qū)域積聚。由于這些原因，適當(dāng)?shù)臏y試需要通過各種方法（通過抽吸，拭子或自然回收手段）回收各種樣品。從這些病毒中回收的臨床樣本來自鼻，鼻咽，喉（口咽），支氣管肺泡，痰，糞便，腦脊髓液和血液成分，例如全血和血清?？梢酝ㄟ^灌洗（洗滌），拭子，吸出物和靜脈放血（撤針，尤其是抽血）來收集樣品。這些可以在圖1中以圖形方式看到。

圖1.（a）人體中顯示的各種樣本位置，包括鼻，鼻咽，口咽/喉嚨和支氣管肺泡。（b）灌洗：將導(dǎo)管放置在所需位置，通過撒藥器沖洗鹽水并收集流出物的支氣管肺泡灌洗（BAL）的示例。（c）抽吸是通過抽吸動(dòng)力導(dǎo)管收集樣品。鼻咽抽吸是一個(gè)例子。（d）如鼻拭子示例所示，將拭子插入該位置以收集

每種病毒可能使用不止一種收集方法。此外，需要在采集地點(diǎn)以外的地方進(jìn)行處理的臨床樣品也必須置于病毒或通用運(yùn)輸介質(zhì)中或冷藏保存（短期為2/8°C，長期為-70 / -80°C期限存儲(chǔ)）。該處理步驟很重要，因?yàn)樗梢员４娌《緲悠芬詡浜笥?/span>。

微流控純化和提取方法

微流控技術(shù)和芯片實(shí)驗(yàn)室（LOC）設(shè)備已實(shí)現(xiàn)了更高通量的病毒樣品純化，這通常是自動(dòng)化的，并且需要更少量的起始臨床樣品。微流控裝置使用各種原理從生物基質(zhì)中提取，純化和濃縮病毒樣品。這些技術(shù)可大致分為（1）基于磁珠，（2）基于液滴，（3）基于結(jié)構(gòu)（4）基于流體特性的方法。這些方法的分類基于導(dǎo)致病毒樣品捕獲的主要成分。

基于粒子的方法

基于粒子的方法涉及向臨床樣品中添加抗體包被的，生物素化的或其他功能化的千分尺或亞微米級顆粒，以從各種臨床樣品中捕獲目標(biāo)病毒?？梢詫⑦@些珠子離心以將其從溶液中除去，因?yàn)樗鼈兊拇笮『兔芏榷急任唇Y(jié)合的病毒大，或者可以通過使用膜過濾來分離，而剩下的廢物則可以流出。在微流體平臺(tái)上很難實(shí)現(xiàn)離心分離，因?yàn)檫@需要更復(fù)雜的微流體設(shè)計(jì)，在某些情況下是由外部設(shè)備執(zhí)行的。

其他基于粒子的方法依賴于磁性功能化粒子從臨床樣品中過濾出病毒樣品。這些磁珠不需要離心，因?yàn)橄到y(tǒng)中的外部磁場作用于它們，將其從溶液中去除。外部磁場由放置在含有微珠的反應(yīng)室上方的磁體感應(yīng)。該方法可以很容易地在微流體裝置上實(shí)施。微流體室的大小，溶液的流速和反應(yīng)體積取決于所施加磁場的強(qiáng)度。為了易于使用，這些磁體產(chǎn)生磁場通常是永久性的。

基于液滴的方法

為了將樣品中的目標(biāo)病原體分類以進(jìn)行分析，開發(fā)了微滴微流控技術(shù)。通過用表面活性劑在油相中乳化包含病原體的水相，可以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞/細(xì)菌/病毒區(qū)室化。大量單分散的油包水液滴的產(chǎn)生頻率為每秒?1000個(gè)液滴。作為病原體和試劑在微液滴包封（直徑約30? μ m和體積?5 PL）中，濃度增加，以提高檢測靈敏度。此外，通過使用液滴分離病原體，大多數(shù)隨機(jī)分子和污染物可以封裝在單獨(dú)的液滴中。

樣品制備方法高度依賴于檢測方法的選擇。與通常用于微流體病毒檢測的基于實(shí)驗(yàn)室的純化方法相比，在單個(gè)微流體芯片中同時(shí)進(jìn)行純化和檢測的同時(shí)演示肯定會(huì)增加制造復(fù)雜性并可能損害測定性能。微流控芯片中主要處理樣品的純化和提取方法PCR和等溫?cái)U(kuò)增、基于抗體的免疫測定的熒光信號?；诿庖邷y定的方法包括電化學(xué)，熒光和光譜/比色檢測。

盡管基于粒子的方法在過去由于試劑和規(guī)程的更多標(biāo)準(zhǔn)/跨平臺(tái)可用性而變得越來越流行，但基于液滴的方法卻因其能夠以非常小的體積執(zhí)行多重實(shí)驗(yàn)并提高了靈敏度而變得越來越受歡迎?；诮Y(jié)構(gòu)的方法在芯片設(shè)計(jì)和易用性方面存在局限性，盡管該方法已顯示出巨大的實(shí)用性，并且必須進(jìn)一步探索以克服這些限制?；跀U(kuò)增的樣品檢測在很大程度上很流行，因?yàn)镽T-PCR可用于非常早地檢測病毒顆粒?；诠庾V/比色檢測的方法還受到不完善的樣品制備方法留下的廢物的嚴(yán)重影響。這些方法因其易用性，敏感性和特異性而具有巨大的潛力，但在完善樣品制備模塊方面還需要做更多的工作。值得注意的是，很少有將電化學(xué)檢測與微流體樣品制備模塊結(jié)合在芯片上的例子。這可能部分是由于歸因于樣品廢物和其他因素的準(zhǔn)確性問題引起的，但應(yīng)進(jìn)一步研究?？傮w而言，可以看出，片上病毒檢測方法與樣品制備模塊的結(jié)合可能有幾個(gè)重要的發(fā)展領(lǐng)域。

微流控設(shè)備的最新進(jìn)展為開發(fā)需要更小，臨床相關(guān)樣本量的高效提取系統(tǒng)打開了大門。適當(dāng)?shù)臉悠芳兓?，濃縮和完整的樣品制備可為資源貧乏的環(huán)境提供可用方案，以解決呼吸道病毒的出現(xiàn)。當(dāng)前，這些設(shè)備仍以可變的高效捕獲機(jī)制和復(fù)雜的設(shè)備制造形式面臨挑戰(zhàn)，然而，新穎方法的發(fā)現(xiàn)以及將這些樣品制備方法與快速新穎的檢測方法結(jié)合起來的進(jìn)一步發(fā)展將使更完整的樣品能夠應(yīng)對目前缺少用于呼吸道病毒的即時(shí)護(hù)理設(shè)備的設(shè)備。

文章節(jié)選自文獻(xiàn)：https://doi.org/10.1063/5.0041089

Microfluidic sample preparation for respiratory virus detection: A review