前言

在過(guò)去的數(shù)十年間，人們通常是將一群細(xì)胞中的每個(gè)細(xì)胞都視為相同的細(xì)胞進(jìn)行研究的。但是，對(duì)這群相同基因的研究往往會(huì)忽視掉每一個(gè)細(xì)胞的特征。因?yàn)榧词故窃趽碛型瑯蛹?xì)胞經(jīng)歷的細(xì)胞種群里，在轉(zhuǎn)錄或翻譯以及信號(hào)通路的噪聲方面，也存在著隨機(jī)波動(dòng)，會(huì)形成內(nèi)在的異質(zhì)性。這些在看似由相同細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞種群里隱藏著的細(xì)胞-細(xì)胞之間的變異也許對(duì)疾病的產(chǎn)生和治療有著重要的意義。例如腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性在理解腫瘤的誘發(fā)、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移與治療應(yīng)答方面就有著重要作用。在臨床前藥物研研發(fā)過(guò)程中，極小比例的一群細(xì)胞亞型也許會(huì)導(dǎo)致腫瘤的抗性，它些細(xì)胞亞型也許與腫瘤患者治療后的復(fù)發(fā)有關(guān)。因此，隨著藥物變得越來(lái)越個(gè)性化，我們有更強(qiáng)的動(dòng)機(jī)來(lái)更加準(zhǔn)確地表示和理解單細(xì)胞以及這些不同的細(xì)胞亞型。對(duì)于細(xì)胞異質(zhì)性的認(rèn)識(shí)已經(jīng)激發(fā)了人們對(duì)單細(xì)胞組學(xué)研究的熱情，這些組學(xué)包括基因組學(xué)、表觀基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)及其內(nèi)在的相互作用。

傳統(tǒng)的激光共聚焦，流式和質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)被廣泛地運(yùn)用到了單細(xì)胞水平的分析上。但是，共聚焦方法存在著局限，例如低通量，成本高，因此在對(duì)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行全局化分析，以及發(fā)現(xiàn)新型細(xì)胞亞型特征方面，使用這些技術(shù)并不現(xiàn)實(shí)。而流式細(xì)胞術(shù)則有著高通量的特點(diǎn)（每秒1000個(gè)細(xì)胞），但也有著局限，其中的局限就是，在流式分析過(guò)程中，細(xì)胞會(huì)受到物理作用，這些物理作用包括流體壓力，激光束照射，靜電壓，高電場(chǎng)，以及與容器壁相撞，這些因素都會(huì)影響細(xì)胞的收率與完整性。雖然前面提到的這些技術(shù)都能確定細(xì)胞表型，但是是流式細(xì)胞儀中采用的抗體是基于先驗(yàn)知識(shí)，它限制了一些新細(xì)胞亞型的發(fā)現(xiàn)。此外，這些方法所需的細(xì)胞數(shù)目大概是100萬(wàn)，同時(shí)它無(wú)法檢測(cè)細(xì)胞隨時(shí)間變化的代謝變化。而流式抗體的熒光光譜也限制了流式抗體的使用數(shù)目，使用參數(shù)過(guò)少。為了解決傳統(tǒng)的流式問(wèn)題，有人開(kāi)發(fā)了基于質(zhì)譜與流式的質(zhì)譜流式細(xì)胞儀，它能使用超過(guò)40個(gè)通道的參數(shù)。質(zhì)譜流式的原理就是，使用重金屬（這些重金屬并不存在于人體內(nèi)，主要是稀有金屬）來(lái)標(biāo)記抗體。但這種技術(shù)還是無(wú)法檢測(cè)細(xì)胞的代謝活動(dòng)，只能靜態(tài)地檢測(cè)細(xì)胞特征。由于質(zhì)譜檢測(cè)器的低靈敏性，質(zhì)譜流式無(wú)法檢測(cè)那些低水平表達(dá)的細(xì)胞特征。并且一次分析的數(shù)目也有上限。

為解決上述問(wèn)題，以微芯片為基礎(chǔ)的單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。微芯片技術(shù)就是通過(guò)在微觀層面形成一個(gè)個(gè)的分析區(qū)室，這個(gè)區(qū)室與一個(gè)細(xì)胞的大小接近，而樣本的收集時(shí)間與反應(yīng)時(shí)間也會(huì)縮短，同時(shí)還具備高通量的特征。此外，微芯片是在層流狀態(tài)下運(yùn)行的，環(huán)境穩(wěn)態(tài)，因此可以在單細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)更加精確、更加靈敏的檢測(cè)。微芯片技術(shù)也為自動(dòng)化，一體化，平行化提供了平臺(tái)，進(jìn)而能節(jié)省人力物力，促進(jìn)單細(xì)胞層面上的研究。

在Figure 1中我們就能看到微芯片技術(shù)在單細(xì)胞層面上的基因組學(xué)、表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)。

基因組

遺傳突變會(huì)導(dǎo)致生物體基因的多樣性，而全基因組測(cè)序可以發(fā)現(xiàn)基因組上的突變，結(jié)構(gòu)變異，非整倍體變化以及重組。但是一個(gè)細(xì)胞的基因組(gDNA)太小，在進(jìn)行測(cè)序之前必須要進(jìn)行擴(kuò)增。現(xiàn)在通常采用PCR或異位多重置換擴(kuò)增反應(yīng)(MDA,isothermal multiple displacement amplification)來(lái)對(duì)單一細(xì)胞的整個(gè)基因組進(jìn)行擴(kuò)增。但這兩種技術(shù)會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增偏倚，例如無(wú)法均一覆蓋整個(gè)基因組，產(chǎn)生嵌合DNA，堿基復(fù)制錯(cuò)誤，假陽(yáng)性，假陰性以及等位基因丟失(ADO，allelic dropouts)等。簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR(Degenerate-oligonucleotide-primed PCR)以及多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增(MALBAC，multiple annealing and loop-based amplification cycling)可以改善單細(xì)胞全基因組的擴(kuò)增效果。雖然這兩種方法比MDA有著更好的均一性，但是缺乏對(duì)全基因組，長(zhǎng)鏈DNA產(chǎn)物的覆蓋，以及對(duì)單核苷酸的突變檢測(cè)能力低。MDA除了有擴(kuò)增不均一以及擴(kuò)增偏倚這種缺點(diǎn)外，它還有其它的一些局限，例如假性引物的相互作用（引物二聚體或DNA污染）來(lái)源的非特異性合成。因此，在單細(xì)胞全基因組測(cè)序領(lǐng)域仍然需要高度均一性以及高保真的擴(kuò)增方法用于精確地識(shí)別indel，CNV，SNV，結(jié)構(gòu)變異等。

為了改善單細(xì)胞WGA的擴(kuò)增均一性以及減少擴(kuò)增偏倚，微流控技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。微流控技術(shù)能將反應(yīng)體系從微升級(jí)(microliter)降低到納升級(jí)(nanoliter)甚至皮升級(jí)(picoliter)，此項(xiàng)技術(shù)能最大程度地降低外源DNA的污染以及交叉污染。因?yàn)樵谖⒘骺貐^(qū)室中，每個(gè)區(qū)室中含有級(jí)少量的DNA片段，這樣在DNA模板，引物與聚合酶之間的競(jìng)爭(zhēng)就會(huì)降低。微流控技術(shù)還能改善反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特異以及提高擴(kuò)增的效率，因此能夠大大降低擴(kuò)增偏倚。此外微流控技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)大量單細(xì)胞的平行高通量分析。

微流控技術(shù)的典型形態(tài)特征就是閥門(mén)，納米孔(nanowell），微滴。通過(guò)將反應(yīng)體系降低到納升級(jí)，基于閥門(mén)的微流控硬件系統(tǒng)就會(huì)捕獲一個(gè)大腸桿菌(Escbericbia coli)細(xì)胞，并擴(kuò)增它的gDNA，一次就能同時(shí)處理9個(gè)樣本，如Figure2所示。這種策略能夠減少試劑用量，降低實(shí)驗(yàn)成本，改善擴(kuò)增特異性（高達(dá)95%）。由于反應(yīng)體系少，假性引物相互作用，DNA模型合成的非特異性，以及擴(kuò)增偏倚都會(huì)降低。

我們將這種微流控系統(tǒng)的思路往前再推進(jìn)一步，那么就可以在96孔板中同時(shí)對(duì)96個(gè)細(xì)胞進(jìn)行捕獲，裂解，擴(kuò)增。這種系統(tǒng)可以整合流體回路，形成大量的納升級(jí)反應(yīng)體系。由于其高通量的特異，每個(gè)細(xì)胞都能產(chǎn)生約150-250ng的DNA，對(duì)一個(gè)細(xì)胞也能實(shí)現(xiàn)多重分析，實(shí)現(xiàn)靶向重測(cè)序，全外顯子測(cè)序（WES）與WGS。微流控系統(tǒng)能夠改善均一性，實(shí)現(xiàn)低ADO率，以及更小的單核苷酸錯(cuò)誤。

微流控的平臺(tái)還能降低反應(yīng)體系，改善WGA的均一性（figure2b）。這種方法可以在數(shù)千個(gè)固定的納升反應(yīng)室中實(shí)現(xiàn)大量平行的DNA擴(kuò)增。這種方法能實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的高度覆蓋，并且在從頭組裝基因組方面也有著極大的改善，它能夠檢測(cè)出一個(gè)成人神經(jīng)細(xì)胞中細(xì)微的體細(xì)胞CNV。有報(bào)道指出，微流控系統(tǒng)能夠覆蓋大腸桿菌88-94%的基因組。

雖然閥門(mén)與微孔技術(shù)常常用于多步單細(xì)胞反應(yīng)，但是精密加工與微流控的控制技術(shù)還存在著一些技術(shù)瓶頸，這些技術(shù)瓶頸限制了最大的樣本加工能力。不過(guò)現(xiàn)在這些問(wèn)題已經(jīng)通過(guò)液滴微流控技術(shù)得到了解決。這些技術(shù)可以將單一細(xì)胞的gDNA片段分散到大量的皮克級(jí)液滴中，在擴(kuò)增中，降低試劑與DNA片段的競(jìng)爭(zhēng)，因此會(huì)在保持高度精確性的同時(shí)，避免擴(kuò)增偏倚（figure2 c）。例如，基因組的覆蓋范圍是59-89%，SNV的錯(cuò)誤率是在20萬(wàn)分之1以下，使用基于液滴的方法可以降低那些擴(kuò)增中的復(fù)制錯(cuò)誤。不過(guò)，這些平臺(tái)在進(jìn)行下流的WGA分析之前，它們分離與選擇單一細(xì)胞要么是手動(dòng)的，要么是FACS途徑。為了進(jìn)一步提升通量，單一液滴MDA(sd-MDA)被開(kāi)發(fā)了出來(lái)，這種sd-MDA技術(shù)通過(guò)一對(duì)一的液滴融合，在微流控的管道中，將MDA的試劑加入到已經(jīng)包裹的單一細(xì)胞液滴中。此技術(shù)能夠在1小時(shí)內(nèi)，1次處理幾萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，同時(shí)能夠?qū)崿F(xiàn)每一個(gè)反應(yīng)小室中更高的均一性與試劑分配，降低樣本與試劑損耗。sd-MDA技術(shù)可以更高范圍地覆蓋細(xì)菌與哺乳動(dòng)物整個(gè)基因組，并降低污染。

雖然傳遞的微流控方法使用的是一些例如閥門(mén)，納米板與液滴技術(shù)，但是一些新的設(shè)計(jì)已經(jīng)用于改進(jìn)WGA。一種無(wú)閥門(mén)微流控設(shè)計(jì)已經(jīng)可以通過(guò)微柱陣列（GAMA，micropillar array）來(lái)實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞基因組擴(kuò)增。當(dāng)單細(xì)胞被芯片捕獲，并裂解后，微柱就能捕獲gDNA， 而其它成分，例如單細(xì)胞的線(xiàn)粒體就被沖走。純化的gDNA隨后就通過(guò)MDA進(jìn)行擴(kuò)增，整個(gè)過(guò)程在一個(gè)穩(wěn)定的微流環(huán)境下進(jìn)行，因此擴(kuò)增產(chǎn)生會(huì)被沖到下游的儲(chǔ)存室，用于分析。通過(guò)基因位點(diǎn)采樣（gene loci sampling）與WES就能比較基于GAMA或基于FACS方法的實(shí)現(xiàn)的基因覆蓋。與FACS技術(shù)相比，在微流孔中能夠?qū)崿F(xiàn)更高的基因組覆蓋，以及更低的擴(kuò)增偏倚。

為了解決傳統(tǒng)復(fù)雜的微流控步驟與芯片平臺(tái)的精密加工問(wèn)題，大量的聚乙二醇水凝膠已經(jīng)用作微流控平臺(tái)來(lái)大量平行地檢測(cè)MDA。通過(guò)形成一個(gè)孔徑25nm的凝膠基質(zhì)，細(xì)胞與DNA模板由于在這種凝膠中分散程度有限，它們就能形成區(qū)室。最終，這些擴(kuò)增的產(chǎn)物就會(huì)局限在這些區(qū)室中，并且能夠最大程度地降低外源DNA的污染與交叉污染。這種方法能夠覆蓋大腸桿菌（E.coli）細(xì)胞基因組的30%，以及覆蓋金黃色釀膿葡萄球菌（Staphylococcus aureus）基因組的60%，其中只有0.5%的嵌合reads。

表觀基因組

表觀遺傳學(xué)研究的是同基因細(xì)胞內(nèi)的功能基因組元件和它們的調(diào)控變化，這些調(diào)控變化能導(dǎo)致不同的基因表達(dá)差異。表觀遺傳修飾包括DNA甲基化，組蛋白修飾與染色質(zhì)組裝和染色體形成，它們?cè)诩?xì)胞行為多樣性，細(xì)胞發(fā)育和疾病方面有著重要的作用。在傳統(tǒng)研究中，我們通常會(huì)檢測(cè)細(xì)胞種群中的大部分細(xì)胞，這種檢測(cè)會(huì)隱藏表觀遺傳的異質(zhì)性，因此最好在單細(xì)胞水平上分析表觀基因組。此外，傳統(tǒng)方法對(duì)于那些低細(xì)胞數(shù)目的樣本并不敏感，并不能發(fā)現(xiàn)這些樣本中的固有的特征。最近發(fā)展的微流控技術(shù)則能夠?qū)渭?xì)胞進(jìn)行高通量、高靈敏地表觀遺傳學(xué)分析。

Buenrostro使用了基于閥門(mén)的微流控平臺(tái)開(kāi)發(fā)了基于轉(zhuǎn)座酶的染色質(zhì)單細(xì)胞分析技術(shù)(scATAC-seq，single-cell assay for transposase-accessible chromatin)。使用這種技術(shù)，他們?cè)谝粋€(gè)集成的微流控芯片(integrated fluidics circuit，IFC)中捕獲并裂解了96個(gè)細(xì)胞。然后在芯片上進(jìn)行ATAC，隨后釋放，Tn5末端延伸，以及PCR。從IFC上收集了單細(xì)胞庫(kù)后，給每一個(gè)細(xì)胞加上條形碼(barcode)，隨后將單細(xì)胞庫(kù)混合起來(lái)進(jìn)行測(cè)序。使用這種方法，作者研究了254GM12878淋巴母細(xì)胞的DNA開(kāi)合性(accessibility)，這些單細(xì)胞來(lái)源的數(shù)據(jù)顯示了整體檢測(cè)(bulk measurement）的相似性。此外，他們還估計(jì)了其它細(xì)胞系中數(shù)千的細(xì)胞的染色質(zhì)開(kāi)合性。DNA甲基化是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳標(biāo)記，通過(guò)亞硫酸氫鹽將胞嘧啶殘基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶就能檢測(cè)DNA的甲基化。單細(xì)胞亞硫酸氫鹽測(cè)序和簡(jiǎn)化代表性重亞硫酸鹽測(cè)序(RRBS,Reduced representation bisulfite sequencing)能夠以人工低通量的方式實(shí)現(xiàn)。此外，一種結(jié)合MDA的甲基化特異性酶鑒別方法能夠?qū)崿F(xiàn)單細(xì)胞水平上的基因組表達(dá)譜與甲基化模式。這些方法都有可能被整合到微流控系統(tǒng)中。例如，基于微流控?cái)U(kuò)散的簡(jiǎn)化代表性重亞硫酸鹽測(cè)序被開(kāi)發(fā)出來(lái)用于檢測(cè)少量細(xì)胞的DNA甲基化，并被應(yīng)用于檢測(cè)小鼠小腦中原代神經(jīng)細(xì)胞和原代膠質(zhì)細(xì)胞的分化。

此外，Rotem還報(bào)道了使用液滴微流控技術(shù)用于分析了數(shù)千個(gè)單細(xì)胞的染色質(zhì)狀態(tài)。在這個(gè)裝置中，單細(xì)胞首選被區(qū)室化，然后裂解，并經(jīng)過(guò)微球菌核酸酶(Micrococcal Nuclease)處理。當(dāng)細(xì)胞被裂解后，染色質(zhì)被片段后，含有染色質(zhì)的液滴與DNA條形碼融合，標(biāo)記每個(gè)最初的細(xì)胞。最后，匯集所有的液滴并測(cè)序。使用這種平臺(tái)，一個(gè)混合了小鼠胚胎干細(xì)胞（ES）、胚胎成纖維細(xì)胞和造血干細(xì)胞的一團(tuán)細(xì)胞就能夠根據(jù)H3K4me2區(qū)室開(kāi)來(lái)。源于數(shù)千的ES細(xì)胞的不同的染色質(zhì)標(biāo)簽也能用于確認(rèn)表觀遺傳的異質(zhì)性。

納米孔也有被報(bào)道用于高通量的scATAC-seq。在這種方法中，大規(guī)模平行的納米孔陣列被用于加載并分離單個(gè)細(xì)胞。然后，另入裂解液，轉(zhuǎn)位試劑(transposition reagent)，EDA，MgCl2，以及PCR試劑。為了確保數(shù)據(jù)是來(lái)源于單個(gè)細(xì)胞，分離的單的細(xì)胞還要進(jìn)行熒光染色。這種方法能夠?qū)崿F(xiàn)高通量（每張芯片1800個(gè)細(xì)胞），短時(shí)間（4到5小時(shí)）與低成本（一個(gè)細(xì)胞不到1美元）的單細(xì)胞表觀遺傳學(xué)測(cè)序。通過(guò)這種平臺(tái)，有人報(bào)道了基于表觀表達(dá)譜的人類(lèi)外周血中的不同細(xì)胞類(lèi)型。

轉(zhuǎn)錄組

轉(zhuǎn)錄組，尤其是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組為我們提供了基因表達(dá)模式的思路，基因的表達(dá)模式反應(yīng)了細(xì)胞的異質(zhì)性。轉(zhuǎn)錄組是由一系列的mRNA轉(zhuǎn)錄本構(gòu)成。當(dāng)內(nèi)部或外部對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響后，例如細(xì)胞的分化狀態(tài)或外部的環(huán)境應(yīng)激，單細(xì)胞的mRNA表達(dá)譜就會(huì)快速地發(fā)生變化。因此，這些mRNA的變化攜帶了有關(guān)細(xì)胞類(lèi)型和狀態(tài)的豐富的生物信息。為了更加全面地理解在細(xì)胞種群與組織中，不同細(xì)胞的狀態(tài)和亞型，有必要來(lái)研究轉(zhuǎn)錄組。

在單細(xì)胞層面上確認(rèn)和定量轉(zhuǎn)錄組的挑戰(zhàn)就是，單細(xì)胞的RNA量很少，只有皮克級(jí)。此外，這些少量的RNA在經(jīng)過(guò)不充分的反轉(zhuǎn)錄后，以及低效率的擴(kuò)增后，那些低豐度的轉(zhuǎn)錄本會(huì)丟失，從而產(chǎn)生偏倚。此外，RNA分子的易揮發(fā)和降解進(jìn)一步降低了轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量，增加了信號(hào)的噪聲，損失了檢測(cè)了精確與可重復(fù)性。為了能夠區(qū)分不同細(xì)胞的類(lèi)型或狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)罕見(jiàn)的細(xì)胞亞型，降低技術(shù)偏差和內(nèi)在噪聲的影響，因此有必要進(jìn)行高通量的單細(xì)胞表達(dá)譜研究。然而，在精確與快速的樣本操作與分離方面面臨著挑戰(zhàn)?；谖⑿酒墓ぞ咄ㄟ^(guò)克服上述局限，它能夠利用少量的RNA，在納升反應(yīng)室中對(duì)其進(jìn)行處理，并能降低污染，減少試劑消耗，提高捕獲效率。微流控平臺(tái)的小型化與并行化提供了更簡(jiǎn)潔，更靈活的單細(xì)操作方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的高通量和低成分的分析方法。

常用的轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)包括RNA熒光原位雜交（RNA-FISH），定量PCR（qPCR）與mRNA-seq。FISH是一種檢測(cè)并定位一個(gè)細(xì)胞中mRNA的有效方法。利用時(shí)序FISH(sequential FISH)和超分辨成像技術(shù)，可以檢測(cè)單細(xì)胞中的數(shù)萬(wàn)個(gè)mRNA。Matsunaga等人開(kāi)發(fā)了一種微流控裝置，可以通過(guò)FISH技術(shù)來(lái)檢測(cè)多達(dá)100個(gè)單細(xì)胞。作者使用采用優(yōu)化了空腔尺寸的聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯的微網(wǎng)，能夠在短時(shí)間內(nèi)高效率地捕獲細(xì)胞。此設(shè)備成功地區(qū)分了不同細(xì)胞種群中的mRNA的表達(dá)水平，并使用FISH檢測(cè)了單細(xì)胞水平上的β-actin。Kao等人開(kāi)發(fā)了另外一種整合FISH微流控平臺(tái)用于檢測(cè)腫瘤細(xì)胞系中的HER2，此平臺(tái)包含一種全自動(dòng)化的FISH程序，如Figure3所示。通過(guò)使用微泵和微閥，在同一個(gè)設(shè)備中可以集成多個(gè)功能，從而DNA探針的使用和操作時(shí)間就會(huì)減少。同時(shí)試劑消耗也會(huì)降低70%。

此外，RT-qPCR廣泛用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，它用于定量基因表達(dá)水平的差異。該技術(shù)有著高靈敏度、高特異性和極大范圍的線(xiàn)性，并已經(jīng)用于單細(xì)胞基因表達(dá)分析，不過(guò)在常規(guī)系統(tǒng)里，它并不可靠。Eastburn使用了一個(gè)基于液滴的微流控裝置，報(bào)道了一次運(yùn)行中的5萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞的RT-PCR（Figure 3e）。使用這種方法可以從混合的細(xì)胞群體中高度特異性地挑出目的細(xì)胞，這表明該方法在稀有細(xì)胞的分析中有著應(yīng)用潛力。液滴微流控平臺(tái)也表現(xiàn)出了對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的高通量分選能力。FISH和RT-PCR平臺(tái)的缺點(diǎn)在于它們采用的是相對(duì)定量的方法，在一次實(shí)驗(yàn)中，它們只能對(duì)已知的基因的數(shù)目進(jìn)行檢測(cè)。因此，這些方法無(wú)法從一個(gè)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)全局的信息。這些方法還依賴(lài)于我們對(duì)目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本的先驗(yàn)知識(shí)，從而阻礙了新基因的發(fā)現(xiàn)。

為了克服FISH和RT-PCR平臺(tái)的局限性，單細(xì)胞RNA測(cè)序現(xiàn)在已經(jīng)成為了分析基因表達(dá)異質(zhì)性的重要工作。這種廣泛應(yīng)用的方法使能夠以一種客觀及無(wú)偏的方式在整個(gè)轉(zhuǎn)錄本水平上對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。在對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分離和裂解后，mRNA被逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后通過(guò)全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增（WTA，whole-transcriptome amplification），最終進(jìn)行測(cè)序。兩種常見(jiàn)的生成cDNA的方式就是oligod(T)錨定和模板轉(zhuǎn)換法(template-switching)。但是oligo-d(T) 錨定法會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的mRNA偏倚，因此這種方法對(duì)3‘末端有著偏好。模板轉(zhuǎn)換法則解決這個(gè)問(wèn)題，這種方法采用了MMVLRT酶(MMVLRT全稱(chēng)是Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase，即莫洛尼鼠類(lèi)白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶)，這種酶具有末端轉(zhuǎn)移酶活性以及模板轉(zhuǎn)移能力。因此，非模板胞嘧啶殘基可以通過(guò)末端轉(zhuǎn)移酶添加到cDNA的3’末端。這種方法就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)多聚鳥(niǎo)苷模板和銜接序列(adaptor sequence)，此序列可以使MMLVRT產(chǎn)生一個(gè)包含完整5'末端的mRNA的全長(zhǎng)的cDNA轉(zhuǎn)錄本。這兩種方法都通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。獨(dú)特分子標(biāo)簽(UMI，Unique molecular identifiers)通常用于在WTA之前對(duì)每個(gè)原始mRNA進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)下游對(duì)原始數(shù)據(jù)的均一化和質(zhì)控能夠降低擴(kuò)增偏倚。擴(kuò)增后的cDNA文庫(kù)被加上條形碼，隨后混合，使用NGS進(jìn)行測(cè)序。

如上所述，基于閥門(mén)的方法通量比較低，并且非常耗時(shí)，還需要專(zhuān)業(yè)的工程學(xué)知識(shí)。盡管存在著這些缺點(diǎn)，基于閥門(mén)的方法也由于其高度可控性而被廣泛使用。Street設(shè)計(jì)了一種RNA測(cè)序微流控裝置，用于在芯片上捕獲，裂解以及逆轉(zhuǎn)錄單細(xì)胞(figure3b)，并且在此芯片上，還能完成polyA加尾，引物消化以及第二鏈cDNA的合成。同時(shí)，該芯片還能實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，純化，文庫(kù)制備和測(cè)序工作，使用此技術(shù)從10個(gè)小鼠的胚胎單個(gè)細(xì)胞中獲取了高質(zhì)量的cDNA，以及在每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到了8000個(gè)基因。使用這種方法還發(fā)現(xiàn)了小鼠骨髓來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞，小鼠大腦細(xì)胞以及人類(lèi)大腦細(xì)胞的多樣性。但是通過(guò)一些手段，例如控制軟件，則能夠增加通量，降低操作時(shí)間，這樣就能最大程度地提高基于閥門(mén)的裝置的利用。這項(xiàng)研究表明，將以前基于手動(dòng)的閥門(mén)微流控進(jìn)行自動(dòng)化后，就能夠極大地提高通量與加工效率。KATARA(全稱(chēng)為Kit for Arduino-based Transistor Array Actuation)也引入了一個(gè)帶圖形用戶(hù)界面的python包，因此這種操作并不需要太專(zhuān)業(yè)的硬件知識(shí)。

此外，基于微孔的方法能夠減少對(duì)專(zhuān)業(yè)設(shè)備的需要，降低未利用到的體積，并有利于實(shí)現(xiàn)并行化操作，從而能夠提供更高的可擴(kuò)展性和簡(jiǎn)并性(Figure3c)。細(xì)胞培養(yǎng)與成像系統(tǒng)也能與微孔平臺(tái)兼容。Seq-Well是一種用于單細(xì)胞RNA測(cè)序的低成本，可移植和大規(guī)模平行測(cè)序的平臺(tái)。這種平臺(tái)可以通過(guò)重力以及加了條形碼的poly(dT)來(lái)捕獲單細(xì)胞，最終能夠?qū)⒓?xì)胞分散在86000個(gè)亞納米孔中。由于每個(gè)納米孔只能容下一顆微珠，裝載效率高達(dá)95%。納米孔是用于半滲透碳酸酯薄膜密封的，而非礦物油。這種膜可以在細(xì)胞裂解過(guò)程中進(jìn)行溶液交換，同時(shí)還能捕獲生物大分子，能夠更好地捕獲mRNA，并最大限度地降低交叉污染。當(dāng)裂解，捕獲mRNA后，就開(kāi)始反轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增，文庫(kù)制備，雙端測(cè)序。這個(gè)硬件已經(jīng)成功地用于研究暴露于結(jié)核分枝桿菌后的數(shù)千個(gè)原代人類(lèi)巨噬細(xì)胞。

基于液滴的方法為單細(xì)胞RNA測(cè)序提供了可擴(kuò)展性，其本身也具有大規(guī)模平行測(cè)序的特點(diǎn)。這類(lèi)方法主要的平臺(tái)就是Drop-seq與InDrop平臺(tái)，它們利用微流控硬件將單個(gè)細(xì)胞人、試劑和加有條形碼的微球或水凝膠微球封閉在油滴中（Figure 3d）。這些條形碼由一個(gè)PCR引物，一個(gè)獨(dú)特的細(xì)胞編碼，一個(gè)UMI構(gòu)成，它們用于區(qū)分捕獲的mRNA，而poly(T)用于與多聚腺苷酸產(chǎn)mRNA結(jié)合。裂解、反轉(zhuǎn)染和PCR都是在液滴中進(jìn)行的。因此這些反應(yīng)被限制在液滴中，而最終擴(kuò)增的轉(zhuǎn)錄本含有獨(dú)特的標(biāo)簽，因此這些平臺(tái)可以將所有的液滴匯集起來(lái)，方便了液滴乳化后的后續(xù)處理過(guò)程以及文庫(kù)制備。當(dāng)測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到一個(gè)參考基因組后，就可以通過(guò)一個(gè)數(shù)字基因表達(dá)矩陣進(jìn)行組裝，再根據(jù)細(xì)胞上的標(biāo)簽來(lái)區(qū)分每個(gè)細(xì)胞，使用UMI來(lái)對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定量。使用這種方法已經(jīng)研究了大量的小鼠ES細(xì)胞和視網(wǎng)膜細(xì)胞，提示了詳細(xì)的群體結(jié)構(gòu)和新的候選細(xì)胞亞型。雖然這些設(shè)備可以低成本地每小時(shí)處理數(shù)以萬(wàn)計(jì)的細(xì)胞，但是在液滴形成過(guò)程中，由于控制較少，因此會(huì)導(dǎo)致封裝效率低下。此外，由于mRNA捕獲效率比較低，這就是限制了這種方法對(duì)于那些低表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本的檢測(cè)。當(dāng)處理含有少量細(xì)胞的小樣本時(shí)，這種方法就會(huì)顯得力不從心。此外，這種方法還需要其他附加設(shè)備，因此限制了其它不同實(shí)驗(yàn)室的使用。

包括miRNA在內(nèi)的小RNA在調(diào)控異質(zhì)性細(xì)胞種群中發(fā)揮著重要作用。miRNA是一類(lèi)小的非編碼RNA，它們?cè)谠S多生物系統(tǒng)中能調(diào)控基因的表達(dá)。在細(xì)胞中，miRNA可以通過(guò)與mRNA互補(bǔ)來(lái)調(diào)控mRNA的表達(dá)，從而誘導(dǎo)mRNA的降解或抑制mRNA的翻譯?，F(xiàn)在已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一些基于微芯片的技術(shù)來(lái)對(duì)miRNA進(jìn)行定量分析。White等人開(kāi)發(fā)了一種帶有可控氣動(dòng)閥門(mén)的微流控裝置用于檢測(cè)單細(xì)胞的miRNA表達(dá)，此裝置還整合了從細(xì)胞捕獲到qPCR的所有處理步驟。該平臺(tái)一次運(yùn)行能夠檢測(cè)300個(gè)細(xì)胞，同時(shí)還能將試劑的消耗降低1000倍。還有人開(kāi)發(fā)了一種流動(dòng)FISH微芯片來(lái)檢測(cè)以及定位miRNA。通過(guò)這種方法，Wu等人以可視化的方式展現(xiàn)了由離子霉素誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞中CD69和miR-155的表達(dá)，并同時(shí)對(duì)PMA進(jìn)行了定量。Guo等人開(kāi)發(fā)了一種連續(xù)流動(dòng)的微流控裝置，此裝置使用DNA雜交的方式擴(kuò)增了目標(biāo)miRNA的信號(hào)，這是一種非PCR式的miRNA分析方法。這種分析方法能夠在油包水的液滴中分離細(xì)胞，此液滴中還含有DNA擴(kuò)增子。當(dāng)細(xì)胞裂解后，miRNA就會(huì)與DNA擴(kuò)增子相互作用引發(fā)雜交反應(yīng)，產(chǎn)生熒光信號(hào)，并循環(huán)產(chǎn)生最初的靶向序列。這種循環(huán)開(kāi)啟了一個(gè)循環(huán)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，放大了的熒光信號(hào)，同時(shí)并不使用PCR對(duì)miRNA進(jìn)行擴(kuò)增。作者采用這種方法能夠在每分鐘內(nèi)處理300到500個(gè)細(xì)胞。對(duì)三種不同的乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行分析后，作者確定了miRNA的表達(dá)水平與腫瘤分期的相關(guān)性。最近，有人報(bào)道了使用少量樣本或單細(xì)胞來(lái)進(jìn)行捕獲，miRNA擴(kuò)增以及測(cè)序。微流控技術(shù)的進(jìn)一步使用將會(huì)對(duì)數(shù)千個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行全基因組測(cè)序。

蛋白質(zhì)組

除了轉(zhuǎn)錄組外，蛋白質(zhì)組有助于構(gòu)建表型與基因型之間的關(guān)系。蛋白質(zhì)組包括膜結(jié)合型蛋白，細(xì)胞質(zhì)蛋白和分泌蛋白。蛋白的濃度、翻譯后修飾、細(xì)胞器轉(zhuǎn)移、酶或功能活性以及與其它蛋白質(zhì)或分子的相互作用也會(huì)影響到蛋白質(zhì)表達(dá)譜。蛋白質(zhì)在細(xì)胞分化、DNA復(fù)制、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝反應(yīng)和分子運(yùn)輸?shù)戎匾募?xì)胞功能方面發(fā)揮著巨大的作用。因此，蛋白質(zhì)組的研究可以推斷生物學(xué)機(jī)制，并能發(fā)現(xiàn)與正常發(fā)育或產(chǎn)生相關(guān)的生物標(biāo)記物、治療靶點(diǎn)和其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)相關(guān)的復(fù)合物。盡管與轉(zhuǎn)錄組相比，蛋白質(zhì)可能具有較少的噪聲，但是要高保真地定量單個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)組的挑戰(zhàn)也更大，部分原因是整個(gè)蛋白質(zhì)組的規(guī)模要大于轉(zhuǎn)錄組的數(shù)量級(jí)，并且大多數(shù)信號(hào)蛋白具有低豐度和不穩(wěn)定性。與DNA和RNA相比，蛋白質(zhì)無(wú)法直接通過(guò)擴(kuò)增來(lái)提高信噪比。蛋白質(zhì)組的極度復(fù)雜性和缺乏一致的通過(guò)探針為單細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析增加了額外的困難。目標(biāo)的技術(shù)在單細(xì)胞水平上檢測(cè)蛋白質(zhì)的通量與靈敏方面仍然存在局限。為了實(shí)現(xiàn)高靈敏度和多路復(fù)用的單細(xì)胞蛋白質(zhì)分析，微生物平臺(tái)已經(jīng)得到了廣泛的研究和使用。

單細(xì)胞可以被包埋在納米孔中，其分泌的蛋白質(zhì)可以被預(yù)涂有抗體的玻片捕獲，每個(gè)細(xì)胞最多能檢測(cè)4個(gè)蛋白。單細(xì)胞條形碼芯片以能夠在單細(xì)胞水平上對(duì)多個(gè)蛋白進(jìn)行檢測(cè)。更特別的地方在于，這些芯片含有預(yù)制備的抗體條帶，這些抗體能覆蓋特定的蛋白，可以通過(guò)熒光免疫分析的手段來(lái)對(duì)蛋白進(jìn)行定量。Ma等人開(kāi)發(fā)了一種單細(xì)胞條形碼芯片（SCBC，single-cell barcode chip），此芯片能夠檢測(cè)單細(xì)胞分泌的一系列蛋白。利用控制閥門(mén)，他們將隨機(jī)加載的單細(xì)胞分散到數(shù)千個(gè)納米孔的微室中。細(xì)胞分泌的蛋白被一個(gè)微室中由DNA編碼的抗體庫(kù)所捕獲，該抗體庫(kù)是以平行條帶的方式來(lái)排列的。蛋白濃度是通過(guò)免疫夾心法熒光成像方式來(lái)進(jìn)行檢測(cè)的。通過(guò)這種平臺(tái)，Ma檢測(cè)了腫瘤抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞分泌的13種效應(yīng)分子。與健康細(xì)胞相比，MART-1（全稱(chēng)為melanoma-associated antigen recognized by T cells 1，T細(xì)胞識(shí)別黑色素瘤抗原-1）特異性T細(xì)胞受體轉(zhuǎn)基因型CTL表現(xiàn)出更高的異質(zhì)性和功能多樣性。

通過(guò)優(yōu)化、簡(jiǎn)化最初的SCBC的參數(shù)，Lu等人報(bào)道了一種帶有5000個(gè)微槽的芯片設(shè)計(jì)，此裝置能夠分離單個(gè)細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行多種蛋白檢測(cè)(Figure 4 a )。與基于閥門(mén)的方法相比，此方法在工作流程和裝置上都減少了復(fù)雜性和體積。細(xì)胞通過(guò)管道輸送到的芯片上，并通過(guò)策略加載到微槽中。通過(guò)位于微槽頂部疊加的高密度的抗體條形碼陣列來(lái)檢測(cè)蛋白，從而會(huì)形成一個(gè)熒光免疫夾心。當(dāng)細(xì)胞孵育12小時(shí)后，分離夾心，使用檢測(cè)抗體來(lái)捕獲相應(yīng)的細(xì)胞因子，并用微陣列掃描儀進(jìn)行定量。通過(guò)結(jié)合不同熒光顏色的光譜編碼和15條空間編碼條帶，該平臺(tái)能夠同時(shí)檢測(cè)42個(gè)效應(yīng)蛋白，這代表了迄今為止單細(xì)胞分泌蛋白分析的最高水平。該裝置與活細(xì)胞工作站和顯微成像系統(tǒng)的兼容也使得分泌蛋白譜與細(xì)胞遷移或相互作用之間的相關(guān)研究成為可能。到目前為止，該平臺(tái)已經(jīng)應(yīng)用于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答、腫瘤發(fā)生和細(xì)胞治療中功能異質(zhì)性的研究。

Hao等人報(bào)道了一種連使用連續(xù)微刻的方法來(lái)監(jiān)測(cè)單細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的時(shí)間動(dòng)力學(xué)。在這種方法中，單個(gè)細(xì)胞被分布和分離在密集的亞納米孔（84672個(gè)）中，頂部有一張抗體包被的玻片，它能同時(shí)監(jiān)測(cè)三種不同的細(xì)胞因子的釋放。為了檢測(cè)在不同時(shí)間間隔內(nèi)單細(xì)胞蛋白的分泌，在不同的時(shí)間點(diǎn)，要將使用過(guò)的抗體包被的玻片換為新制備的玻片。使用這種方法，研究人員檢測(cè)了非粘附T細(xì)胞和粘附巨噬細(xì)胞的動(dòng)態(tài)細(xì)胞因子分泌。Lu等人展示了玻片交換過(guò)程中可以加入一個(gè)干擾步驟。作者因此在使用LPS刺激同一巨噬細(xì)胞前后，在同一巨噬細(xì)胞上檢測(cè)了42種不同的分泌蛋白。

除了使用抗體包被的基質(zhì)（如玻片）捕獲目標(biāo)蛋白外，與微球結(jié)合的抗體也是繼液滴或微孔內(nèi)的單細(xì)胞分離之后進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測(cè)的重要工具 (Figure 4 b )。Konry開(kāi)發(fā)了一種使用液滴微流控技術(shù)來(lái)包裹T細(xì)胞，捕獲抗體修飾微球的技術(shù)，此技術(shù)通過(guò)熒光標(biāo)記的二抗來(lái)檢測(cè)蛋白的分泌。雖然這種方法允許在活化的輔助性T細(xì)胞中檢測(cè)IL-10的分泌，但是這種檢測(cè)方法限制了可以同時(shí)檢測(cè)的多個(gè)蛋白，并且操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。另外，單細(xì)胞和功能化的抗體微球也可以與熒光標(biāo)記的二抗包埋在微流控和反應(yīng)區(qū)室中。然后根據(jù)微球的熒光強(qiáng)度，可以隨著時(shí)間的推移來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞分泌的活動(dòng)的動(dòng)態(tài)特征。

除了使用閥門(mén)、微孔或液滴這些傳統(tǒng)方法外，納米孔-杠桿技術(shù)最近也成為了檢測(cè)單細(xì)胞分泌體的一種新的解決方案（figure 4c)。這種方案提供了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，例如實(shí)時(shí)檢測(cè)、單分子級(jí)的靈敏度，以及不依賴(lài)于抗體的先驗(yàn)知識(shí)。為了能檢測(cè)分泌蛋白，在微流控裝置內(nèi)的納米孔里，使用光鑷來(lái)捕獲單個(gè)細(xì)胞。分泌的細(xì)胞蛋白通過(guò)納米孔產(chǎn)生明顯的阻斷電流，電泳的大小與蛋白的體積有關(guān)。Kennedy等人使用這種方法實(shí)時(shí)區(qū)分了三種不同的腫瘤細(xì)胞株，U937、MDA-MB-231和MCF-7，并對(duì)趨化因子CCL5和其它低豐度的生物標(biāo)記物（PI3，TIMP1和MMP1）進(jìn)行了鑒定和動(dòng)態(tài)追蹤。

上述提到的方法是以無(wú)損傷的方式檢測(cè)細(xì)胞的分泌蛋白。但是，如果要研究胞內(nèi)蛋白，就必須要在微流控芯片上集成細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)釋放和最終檢測(cè)等功能。一種基于閥門(mén)的方法就能解決這種問(wèn)題，在這種平臺(tái)上，當(dāng)單細(xì)胞通過(guò)三態(tài)閥被分離，裂解，加標(biāo)簽后，再利用單分子熒光計(jì)數(shù)手段來(lái)對(duì)蛋白進(jìn)行區(qū)分和定量。通過(guò)這種靶向方法，不需要的蛋白就通過(guò)電泳的方式?jīng)_走，而柱面光學(xué)系統(tǒng)則用于定量感興趣的蛋白。Shi等人報(bào)道了通過(guò)引入含有裂解液的額外相鄰腔室的改進(jìn)型SCBC（Figure 4d）。使用這種方法，捕獲的單細(xì)胞就能在芯片上進(jìn)行裂解，隨后分散到裂解液中，翻譯出來(lái)的蛋白質(zhì)通過(guò)含有11種抗體的條形碼帶進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)這種平臺(tái)，他們研究了三種腫瘤膠質(zhì)母細(xì)胞瘤多形細(xì)胞株在不同刺激條件下的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白。為了提高檢測(cè)那些低拷貝數(shù)的胞內(nèi)蛋白質(zhì)靈敏度，使用微孔（60pL）來(lái)提高釋放的蛋白濃度，并減少細(xì)胞裂解后蛋白擴(kuò)散的時(shí)間。Yang等人報(bào)道了，使用4種不同大小和3種不同熒光顏色的抗體結(jié)合微珠檢測(cè)了分離出來(lái)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的12種蛋白。

此外，Abseq方法能達(dá)到更高的通量，它每小時(shí)能分析10000個(gè)細(xì)胞的蛋白，并能夠檢測(cè)出更多的膜蛋白（Figure 4e）。在這種技術(shù)里，抗體使用了DNA標(biāo)記，并含有一個(gè)UMI，還含有抗體特異性序列，它們能夠分別識(shí)別PCR的重復(fù)序列，以及感興趣的蛋白。分離了單細(xì)胞后，使用蛋白質(zhì)酶K裂解液來(lái)裂解細(xì)胞。然后，通過(guò)三個(gè)液滴的融合，將單細(xì)胞裂解產(chǎn)物、單細(xì)胞條形碼和生成的PCR合并成一個(gè)。隨后使用重疊延伸PCR技術(shù)將細(xì)胞特有的條形與抗體條形碼耦合起來(lái)。通過(guò)增加每個(gè)抗體的DNA標(biāo)記數(shù)，可以進(jìn)一步優(yōu)化檢測(cè)靈敏度。到目前為止，這種方法僅限于檢測(cè)表面蛋白。但是，從理論上講，序列標(biāo)簽可以唯一地標(biāo)記針對(duì)細(xì)胞內(nèi)分泌蛋白或整個(gè)蛋白質(zhì)組的抗體，這就能夠有更大的機(jī)會(huì)找到新發(fā)現(xiàn)。

單細(xì)胞Western blotting(scWestern)是另外一種分析蛋白方法。Hughes等人使用scWestern技術(shù)，一次分析了數(shù)千個(gè)單細(xì)胞中的2到3個(gè)蛋白，但是如果重復(fù)漂白和復(fù)染，則能檢測(cè)多達(dá)11個(gè)靶蛋白(Figure 4 f )。當(dāng)細(xì)胞在開(kāi)放的微孔陣形中鎖定后，單個(gè)細(xì)胞就在芯片上被裂解。然后使用PAGE凝膠電泳分離細(xì)胞裂解液中的蛋白，隨后使用光引發(fā)印跡（photoinitiated blotting）方法來(lái)固定蛋白。最終使用熒光標(biāo)記的抗體進(jìn)行檢測(cè)，并用微陣列掃描儀進(jìn)行定量。Hughes使用這方法不僅可以檢測(cè)蛋白，還能夠區(qū)分異構(gòu)體。該方法還可以應(yīng)用于大刀神經(jīng)干細(xì)胞、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，CTCs以及不同亞細(xì)胞區(qū)室的分析。

最后，細(xì)胞免疫染色是一種直接的檢測(cè)胞內(nèi)蛋白的技術(shù)，它可以很容易地集成到微流控芯片中?？梢允褂盟畡?dòng)力，電活性微孔陣列或數(shù)字微流控裝分離單個(gè)細(xì)胞，并使用免疫化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。染色的細(xì)胞隨后可以通過(guò)熒光顯微鏡或微流控流式細(xì)胞術(shù)來(lái)進(jìn)行分析。Ng等人已經(jīng)使用此策略來(lái)對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、刺激和檢測(cè)。這種裝置能用于檢測(cè)血小板衍生生長(zhǎng)因子受體及其下游信號(hào)蛋白Akt的磷酸化狀態(tài)，研究化學(xué)刺激對(duì)血小板衍生生長(zhǎng)因子受體磷酸化狀態(tài)的影響。

代謝組學(xué)

單細(xì)胞水平上的代謝物為基因型和表型之間提供了另一種聯(lián)系。代謝物包括所有的細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞膜和分泌型代謝物，包括脂質(zhì)和碳水化合物。單細(xì)胞代謝譜與其它組數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合時(shí)，通過(guò)提供代謝中間產(chǎn)物的更全面的數(shù)據(jù)，有助于識(shí)別基因型-表型的相關(guān)性。最近，代謝組學(xué)已經(jīng)應(yīng)用于藥物開(kāi)發(fā)和傳遞，毒理學(xué)以及生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)。然而，由于代謝物比生物分子（例如DNA和蛋白質(zhì)）小，因此很難于其進(jìn)行表征。從傳統(tǒng)角度來(lái)講，多個(gè)單細(xì)胞隔離平臺(tái)，例如使用激光燒蝕電噴霧電離(LAESI)和基質(zhì)輔助激光解吸離子化技術(shù)（Matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI)結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)來(lái)分析代謝物。然而，由于代謝物比生物分子更小，傳統(tǒng)的方法無(wú)法在不成比例地稀釋樣本或總體樣本損失的情況下來(lái)處理如此小的樣本。這些方法也缺乏檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞中存在的微量代謝物所需要的靈敏度。

微流控裝置作為單細(xì)胞高通量代謝研究的有力工具，具有很大的應(yīng)用潛力。盡管微流控裝置已經(jīng)被用于研究代謝物的平臺(tái)，但是很少有研究將其應(yīng)用于單細(xì)胞水平上代謝物。另一個(gè)挑戰(zhàn)則是，大多數(shù)單細(xì)胞裝置只出現(xiàn)在特定代謝物上，限制了它們?cè)谔厥忸I(lǐng)域的應(yīng)用，無(wú)法實(shí)現(xiàn)多個(gè)代謝物的分析。此外，由于特定的代謝物研究是基于先驗(yàn)知識(shí)，有關(guān)新發(fā)現(xiàn)的機(jī)遇仍然只限于微型硬件技術(shù)。盡管微流控技術(shù)在提高通量方面有著巨大的潛力，但是它們?cè)诟淖冋５募?xì)胞行為方面還存在著挑戰(zhàn)。這會(huì)產(chǎn)生一些人為因素，這些因素有可能不利于代謝組學(xué)的研究，因?yàn)榇x物在單細(xì)胞水平上的濃度極小。盡管存在著這些挑戰(zhàn)，但是單細(xì)胞代謝組學(xué)的分析系統(tǒng)仍然在進(jìn)步中。

Cheng等人提出一種微電極-微流控系統(tǒng)，此系統(tǒng)可以產(chǎn)生單個(gè)跳動(dòng)的心臟細(xì)胞的代謝譜。在人工模擬心臟跳動(dòng)的微電極場(chǎng)刺激后，電化學(xué)生物傳感器就會(huì)檢測(cè)單細(xì)胞中乳酸的生成。細(xì)胞外pH和細(xì)胞內(nèi)鈣熒光，以及細(xì)胞收縮力，也能通過(guò)原位顯微鏡進(jìn)行評(píng)估，這種技術(shù)為心臟細(xì)胞的電位狀態(tài)和代謝狀態(tài)指明了方向。

在一個(gè)高通量的研究中，Boedicker等人使用基于插頭的微流控將單個(gè)細(xì)菌捕獲到納米液滴中。釋放的代謝物可以更容易地通過(guò)隨機(jī)約束（stochastic confinement），在這種情況下，代謝物會(huì)保留在細(xì)胞附近。研究者利用利用甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌的代謝譜檢測(cè)了藥物的最低抑菌濃度，并從人血漿標(biāo)本中鑒定出敏感和耐藥的金黃色葡萄球菌菌株。該平臺(tái)有利于對(duì)同一樣本進(jìn)行多種檢測(cè)，說(shuō)明了其在有效的點(diǎn)對(duì)點(diǎn)診斷和針對(duì)患者的細(xì)菌感染治療方面有著應(yīng)用。

單細(xì)胞代謝物可以通過(guò)特定傳感分子來(lái)檢測(cè)。Tang等人開(kāi)發(fā)了一種用于胸腔積液腫瘤細(xì)胞葡萄糖攝取測(cè)量的微孔芯片平臺(tái)(Figure 5a )。當(dāng)細(xì)胞被加載到含有200000個(gè)微孔的設(shè)備上時(shí)，一個(gè)熒光葡萄糖類(lèi)似物2-NBGD就加進(jìn)去，與細(xì)胞共同孵育，然后用自動(dòng)高速熒光顯微鏡對(duì)微孔芯片進(jìn)行掃描。使用計(jì)算機(jī)算法對(duì)圖片進(jìn)行分析，以確定標(biāo)記出那些高葡萄糖攝取的癌細(xì)胞，以便于進(jìn)行后續(xù)的單細(xì)胞測(cè)序。此外，Molter等人設(shè)計(jì)出了一種玻璃微芯片，該芯片包含一個(gè)氧傳感器，氧傳感器是由鉑磷-聚苯乙烯珠制成的，并沿著微孔底部分布。當(dāng)細(xì)胞浸入培養(yǎng)基中，并接種后，有一個(gè)連接在活塞上的玻璃蓋子就會(huì)關(guān)閉，在微孔上形成一個(gè)封閉膜，隨后就檢測(cè)氧含量。

另外，Xue等人報(bào)告了一種通過(guò)SCBC對(duì)單個(gè)細(xì)胞的代謝物和蛋白質(zhì)進(jìn)行多重分析的，集成自動(dòng)化微芯片方法 (Figure 5 b )。他們使用DEAL方法，將代謝物特異性的大分子探針和蛋白捕獲抗體固定在單細(xì)胞微室的條形碼上。單細(xì)胞（每張芯片100個(gè)細(xì)胞）通過(guò)裂解液在芯片上裂解，然后用可編程閥門(mén)進(jìn)行分割。代謝物是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的手段來(lái)進(jìn)行分析的，而蛋白質(zhì)則是通過(guò)可視化的夾心免疫熒光法來(lái)進(jìn)行分析。利用這種平臺(tái)，研究人員使用了表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑(EGFR)埃洛替尼(Erlotinib，此藥物能夠降低腫瘤細(xì)胞的葡萄糖消耗)治療24小時(shí)后，研究了每個(gè)患者來(lái)源的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤神經(jīng)球腫瘤模型細(xì)胞的代謝物。作為葡萄糖消耗的替代品，有4種代謝產(chǎn)物和7種與代謝相關(guān)蛋白質(zhì)和磷酸化蛋白被納入檢測(cè)范圍，數(shù)據(jù)都表明了葡萄糖的攝入量總體上是減少的。此外，還能通過(guò)多個(gè)代謝產(chǎn)物的摻入來(lái)鑒定出兩種不同的代謝表型。

Xue還開(kāi)發(fā)了一種整合了用于定量單個(gè)細(xì)胞攝取谷氨酰胺的表現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)分析方法的SCBC芯片。他們分析了16種代謝物、磷酸蛋白和相關(guān)代謝酶。在先前工作的基礎(chǔ)上，他們使用芯片研究了埃洛替尼治療后勢(shì)能與受體酪氨酸激酶信號(hào)之間的關(guān)系。這些單細(xì)胞的研究表明，盡管葡萄糖攝取和磷酸化蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)減弱了，但是癌細(xì)胞的勢(shì)能卻增加了。此外，他們還發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞通量過(guò)程和磷蛋白信號(hào)之間的新的相互作用，這就能解釋癌癥患者隊(duì)列中對(duì)EGFR抑制劑的耐藥性。

多組學(xué)

盡管基因組學(xué)、表觀基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等技術(shù)在分析單細(xì)胞方面取得了進(jìn)展，但是單獨(dú)評(píng)估每一類(lèi)分子還不足以充分了解復(fù)雜的生物系統(tǒng)以及潛在的調(diào)控機(jī)制。通過(guò)測(cè)量同一個(gè)單細(xì)胞的多組學(xué)水平，而不是合并從不同細(xì)胞獲得的不同數(shù)據(jù)集，就可以清楚地確定基因型-表型連接。通過(guò)這些平行的研究，就可以闡明更復(fù)雜的作用機(jī)制的細(xì)胞異質(zhì)性。例如，對(duì)表觀基因組的研究就可以更好地理解對(duì)細(xì)胞特性、功能和表型的調(diào)節(jié)，而這些則無(wú)法單獨(dú)從基因型來(lái)預(yù)測(cè)。此外，miRNA與mRNA的共序列分析，則對(duì)miRNA導(dǎo)致的非遺傳性細(xì)胞異質(zhì)性的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和miRNA通過(guò)蛋白質(zhì)編碼區(qū)基因調(diào)控提供了新的思路。另外，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的研究則提供了表達(dá)動(dòng)力學(xué)的研究思路。隨著這些研究為細(xì)胞異質(zhì)性提供了更加全面的理解，這些技術(shù)在人類(lèi)健康和疾病方面的應(yīng)用將會(huì)繼續(xù)推進(jìn)。這樣的技術(shù)伴隨著對(duì)醫(yī)學(xué)研究有更深理解力以及促進(jìn)的巨大潛力，微流控設(shè)備現(xiàn)在已經(jīng)日益推動(dòng)著多組學(xué)研究的進(jìn)步。然而，現(xiàn)在想要在同一個(gè)設(shè)備上對(duì)同一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行多個(gè)層次組學(xué)的研究還是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的工作。這是由于不同的生物分子檢測(cè)和方案的不兼容性，這些不同的分子具有著不同的靈敏性和特異性要求。

Hao等人報(bào)道了一種集成的微芯片平臺(tái)，該平臺(tái)帶有可控的膜閥，可以同時(shí)對(duì)同一單細(xì)胞進(jìn)行WGA和WTA，從而對(duì)來(lái)自同一個(gè)單細(xì)胞的基因和轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行檢測(cè)。這種方法允許在芯片上分離和擴(kuò)增來(lái)自于同一個(gè)單細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)mRNA和細(xì)胞核的gDNA。在微室中捕獲單細(xì)胞后，使用高選擇性裂解液連續(xù)裂解細(xì)胞膜和細(xì)胞核，分別收集胞漿和細(xì)胞核內(nèi)容物。然后在該裝置上將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并對(duì)同一細(xì)胞的cDNA和gDNA進(jìn)行全庫(kù)擴(kuò)增(Whole pool amplification,WPA)。在進(jìn)行PCR后，進(jìn)行凝膠電泳，測(cè)序，最終就能夠鑒定出來(lái)自于同一單細(xì)胞的基因組和轉(zhuǎn)錄信號(hào)。這種技術(shù)進(jìn)步提供了研究干細(xì)胞發(fā)育控制、非基因細(xì)胞間變異性、表觀遺傳調(diào)控和其它基礎(chǔ)生物學(xué)問(wèn)題的解決方案。

Strijp等人開(kāi)發(fā)了另外一種方法，這種方法利用壓力驅(qū)動(dòng)的微流控來(lái)研究基因組和轉(zhuǎn)錄組。在這種微流控芯片上，使用水捕獲單個(gè)細(xì)胞，然后依次導(dǎo)入細(xì)胞膜和細(xì)胞核裂解液，提取芯片上的單細(xì)胞DNA和RNA。這種兩步驟裂解法避免了專(zhuān)門(mén)的清洗步驟，從而減少了樣本的損失。從每個(gè)微孔中收集每個(gè)細(xì)胞的裂解液，然后在芯片上進(jìn)行DNA的WGA。在芯片上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和RNA擴(kuò)增后，就可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。這種技術(shù)和貝葉斯計(jì)算通路模擬的整合已經(jīng)用于從大腸癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中識(shí)別單個(gè)細(xì)胞的腫瘤驅(qū)動(dòng)通路。這些通路后的驅(qū)動(dòng)突變都來(lái)源于同一個(gè)單細(xì)胞的DNA。此平臺(tái)有望用于腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性的研究，并通過(guò)其功能和突變途徑的建立來(lái)分析單個(gè)CTCs。Cheow等人通過(guò)一種基于閥門(mén)的自動(dòng)化高通量微流控平臺(tái)在單細(xì)胞水平上同時(shí)檢測(cè)了DNA甲基化和基因表達(dá)，這種技術(shù)作者稱(chēng)之為基因型，表達(dá)與甲基化的單細(xì)胞分析（single-cell analysis of genotype, expression, and methylation），作者研究了正在進(jìn)行重編程的原發(fā)性肺腺癌和人類(lèi)成纖維細(xì)胞。

單細(xì)胞多組學(xué)的另外一個(gè)研究主題就是轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)的相互作用。George & Wang開(kāi)發(fā)了一種微流控裝置，可以對(duì)同一個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本和分泌蛋白進(jìn)行研究。這種可拆分的單細(xì)胞芯片集成了一個(gè)高度密度的抗體陣列來(lái)檢測(cè)膠原包被的納米孔中的分泌蛋白。當(dāng)?shù)鞍妆籈LISA分析后，再通過(guò)手動(dòng)操作通過(guò)WTA對(duì)單細(xì)胞的mRNA進(jìn)行測(cè)序。作者通過(guò)這一工作流程，他們鑒定出了一類(lèi)與小鼠巨噬細(xì)胞中腫瘤壞死因子α分泌相關(guān)的共表達(dá)基因的細(xì)胞亞型，表明它有可能對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制提供新的思路。Junkin等人使用一種基于閥門(mén)的自動(dòng)微流控平臺(tái)，在同一臺(tái)裝置上檢測(cè)了細(xì)胞因子動(dòng)力學(xué)和LPS刺激巨噬細(xì)胞后的mRNA轉(zhuǎn)錄本。在這種裝置里，抗體功能化微球與單個(gè)細(xì)胞共培養(yǎng)，可以檢測(cè)細(xì)胞因子的分子。通過(guò)雙抗體夾心法可以檢測(cè)細(xì)胞因子的熒光強(qiáng)度。最終對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行mRNA檢測(cè)。還有人通過(guò)一種基于閥門(mén)的平臺(tái)，研究了在佛波酯的干預(yù)下，MCF7細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的應(yīng)答情況。

液滴微流控裝置是同時(shí)檢測(cè)RNA表達(dá)和蛋白質(zhì)的另外一種強(qiáng)大的工具。在與DNA條形碼抗體共同孵育后，染色的細(xì)胞就被包裹在含有微珠的納米液滴中，這樣就能捕獲mRNA與寡核苷酸標(biāo)記的抗體。經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增和測(cè)序后，從轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組中獲得的信息就能被解析出來(lái)。作者使用了這種方法對(duì)人源CD8+淋巴細(xì)胞和臍帶血單個(gè)細(xì)胞的異質(zhì)性進(jìn)行了研究。最近，一種基于核酸適配體(Aptamer)的技術(shù)被開(kāi)發(fā)了出來(lái)，用于平行研究轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組。這種方法使用核酸適配體探針來(lái)標(biāo)記那些含有表位與目標(biāo)蛋白的細(xì)胞，并將其與DNA條形碼微珠和裂解液共同包埋起來(lái)。mRNA的polyA序列與核酸適配體就會(huì)使得細(xì)胞裂解后與微珠雜交。當(dāng)進(jìn)行了RT和PCR之后，就匯集所有的液滴，進(jìn)行平行測(cè)序。由于含有共同的細(xì)胞特異性條形碼，這種平臺(tái)就是能串聯(lián)分析細(xì)胞全局?jǐn)?shù)據(jù)（epitome ）與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。這種平臺(tái)能夠基于核酸適配體表面結(jié)合以及基因表達(dá)模式來(lái)區(qū)分不同細(xì)胞類(lèi)型。

如上所述，Xue等人報(bào)道了一種基于閥門(mén)的SCBC，此技術(shù)整合了表面競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析法與功能蛋白免疫分析法，以及熒光讀數(shù)法，能同時(shí)研究代謝物和蛋白質(zhì)。此外，Zhang等人使用納米孔技術(shù)展示了一種基于微芯片的平臺(tái)，該平臺(tái)能夠使用基于圖像的流式技術(shù)與抗體編碼微陣形技術(shù)來(lái)檢測(cè)單個(gè)CTC的葡萄糖攝取和胞內(nèi)功能蛋白。從裂解的細(xì)胞中提取單個(gè)細(xì)胞核，隨后進(jìn)行基因突變的研究。

總結(jié)與未來(lái)展望

微芯片技術(shù)的小型化和并行化為單細(xì)胞組學(xué)的研究提提供了前所未有機(jī)遇，這是因?yàn)槲⑿酒夹g(shù)提高了單細(xì)胞組學(xué)的通量、靈敏度和可控性，降低了樣本消耗。正如本文所討論的，這些方法在細(xì)胞發(fā)育和異質(zhì)性方面的新發(fā)現(xiàn)和獨(dú)特發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)研究和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)提供了最新的工具。

盡管前人做了大量的工作，但是在利用微流控平臺(tái)進(jìn)行單細(xì)胞組學(xué)研究時(shí)，仍然存在著大量懸而未決的問(wèn)題。未來(lái)研究的一個(gè)方向就是進(jìn)一步提高靈敏度、通量和多路復(fù)用，進(jìn)而減少組學(xué)研究中的誤差和偏倚。此外，具有不同模式的微芯片器件的多樣性給質(zhì)量帶來(lái)了很大的挑戰(zhàn)，因此制定分析標(biāo)準(zhǔn)與結(jié)果解讀標(biāo)準(zhǔn)對(duì)未來(lái)的進(jìn)一步的發(fā)展有著重要意義。

此外，從同一個(gè)細(xì)胞上平行測(cè)量多個(gè)水平的基因組特性仍然不太完善，但是為了更準(zhǔn)確和更全面地了解細(xì)胞類(lèi)型的狀態(tài)，這還是有必要的。雖然近年來(lái)在綜合多組學(xué)方面取得了很大的進(jìn)展，但是這些技術(shù)大多只能同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)組學(xué)層次或三個(gè)組學(xué)層次。理想的平臺(tái)則是能夠提供各個(gè)分子水平上綜合信息。此外，在芯片上集成這些細(xì)胞組學(xué)的數(shù)據(jù)與細(xì)胞表型結(jié)合（例如細(xì)胞的大小與形態(tài)）以及動(dòng)態(tài)特征（例如細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移和細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用），能夠最大程度地提供更多的信息輸出。為了從同一個(gè)細(xì)胞中獲取這些聯(lián)系，需要一種精確、簡(jiǎn)便的下游分子圖譜檢索方法。如果能夠在單細(xì)胞水平上完全將這些分子特性轉(zhuǎn)換為細(xì)胞行為，則能夠?yàn)檠芯刻峁?qiáng)有力的支撐。這些未來(lái)的進(jìn)展可能會(huì)增加單細(xì)胞數(shù)據(jù)的集的復(fù)雜性和廣度，從而?新型的計(jì)算模型來(lái)拆分高維數(shù)據(jù)。另外，在單細(xì)胞處理過(guò)程中，在保留三維位置空間信號(hào)的同時(shí)，對(duì)多組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合的手段還不成熟，從而阻礙了對(duì)復(fù)雜生物組織結(jié)構(gòu)和功能的全面理解。

最后，基于微芯片技術(shù)的商化和臨床轉(zhuǎn)化還有很長(zhǎng)的路要走。為了加速這些技術(shù)在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中的廣泛應(yīng)用，必須開(kāi)發(fā)出功能強(qiáng)大、用戶(hù)友好的硬件設(shè)計(jì)。微流控裝置的集成和自動(dòng)化不僅降低了生物學(xué)家和臨床醫(yī)生的使用門(mén)檻，并且還能減少人工操作，節(jié)省時(shí)間。這種做法還能降低用戶(hù)的實(shí)驗(yàn)偏倚，并提高不同實(shí)驗(yàn)室之間研究的可重復(fù)性，這些都是當(dāng)前人工操作過(guò)程中需要注意的問(wèn)題。成本很有可能是在單細(xì)胞組學(xué)研究中廣泛應(yīng)用微芯片的另外一個(gè)障礙，這個(gè)問(wèn)題可能通過(guò)進(jìn)一步改進(jìn)工作流程來(lái)得到解決，例如減少反應(yīng)試劑的用量，提高樣本的處理能力。這些設(shè)備的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)?；a(chǎn)也會(huì)有助于降低成本。

通過(guò)基因組學(xué)、表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的多組學(xué)微流控制技術(shù)的流水化集成，就能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)細(xì)胞全部異質(zhì)性的達(dá)珍。通過(guò)解決通量低，低靈敏底，研究水平低、缺乏足夠和可行的計(jì)算模型以及微流控器件高成本等問(wèn)題，研究者和從業(yè)人員可以在與健康和疾病相關(guān)的細(xì)胞亞型和物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)中使用這些技術(shù)，從而推動(dòng)單細(xì)胞組學(xué)在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)中的廣泛應(yīng)用。