近年來越來越多的證據(jù)表明，活性氧簇具有生長抑制效果，例如過氧化氫能夠?qū)е卵趸瘧?yīng)激和細胞損傷，由于在人工生長培養(yǎng)基中產(chǎn)生了過氧化氫，導致微生物的生長效率明顯降低。雖然分子生態(tài)學和宏基因組學已經(jīng)明顯增加了我們對于微生物多樣性的了解，并且引導產(chǎn)生了許多有趣的假設(shè)，但是這些先進的技術(shù)也顯示出我們距離充分闡明微生物多樣性還很遠。同時，考慮到許多基因儲存在具有未知功能或錯誤注釋的數(shù)據(jù)庫中，僅使用宏基因組學的方法不能提供足夠的信息去培養(yǎng)所有的微生物。實際上，只有通過細菌純培養(yǎng)的研究才能充分地闡述其表型和基因型。考慮到微生物培養(yǎng)在現(xiàn)代微生物學中的重要性，分離培養(yǎng)未培養(yǎng)微生物仍然是優(yōu)先考慮的思路。因此，一個重要的挑戰(zhàn)就是如何克服目前存在的限制因素，擴大可培養(yǎng)的范圍。本文將綜述目前未培養(yǎng)微生物分離培養(yǎng)技術(shù)研究進展(表1)，為分離未培養(yǎng)微生物和研究其生態(tài)學功能提供參考。

1未培養(yǎng)微生物的限制因素

1.1 培養(yǎng)基組分和生長條件不全面

任何微生物的生長都需要能量、營養(yǎng)和適當?shù)奈锢砘瘜W成分，并且不同的微生物所需的濃度是不同的。某些微生物在生長的過程中，需要特殊的營養(yǎng)物質(zhì)、pH條件、培養(yǎng)溫度和合適的氧氣濃度。K?pke等研究不同的培養(yǎng)基基質(zhì)和培養(yǎng)條件對微生物生長的影響后發(fā)現(xiàn)，不同的條件下微生物生長出現(xiàn)明顯差異。

1.2 忽視了環(huán)境中微生物之間的相互作用

自然環(huán)境中的大部分微生物都是群體生活，并且相互之間建立了復雜的關(guān)系。在實驗室培養(yǎng)條件下，單純地將待培養(yǎng)的微生物與其他相關(guān)的微生物群體分開，物種之間的信息交流被阻斷，微生物因缺乏必需的生長因子和信號分子而無法生長，表現(xiàn)為不可培養(yǎng)。在原核生物中，種間互作普遍存在并且不會受到信號分子的限制，例如自體誘導分子2(AI-2)和N-?；?高絲氨酸內(nèi)酯。

培養(yǎng)時間短

在某些情況下，培養(yǎng)效率隨著培養(yǎng)時間的延長而明顯增加。許多微生物，特別是生活在營養(yǎng)不充足環(huán)境中的微生物生長速率是很慢的。因此，延長培養(yǎng)時間是提高這類微生物培養(yǎng)效率的先決條件。Davis等培養(yǎng)土壤微生物至少12周的時間，結(jié)果顯示菌落計數(shù)明顯增加并且分離出幾株之前未培養(yǎng)的菌株。

檢測靈敏性受限

對于某些微生物生長速率慢、產(chǎn)量低的情況，如果檢測技術(shù)靈敏性不高，很可能得出錯誤的結(jié)論，因此開發(fā)多種高靈敏性檢測方法對于認識未培養(yǎng)微生物具有很大的作用。對于要通過菌落數(shù)量來研究其生理生態(tài)特性的微生物，高靈敏性的檢測方法如切向流過濾是極其重要的。

2未培養(yǎng)微生物培養(yǎng)分離技術(shù)

2.1調(diào)整培養(yǎng)基

在生長的過程中，許多微生物有特殊的營養(yǎng)物質(zhì)和化學物質(zhì)的需求。這就需要對微生物生存的自然環(huán)境和特性有深刻的理解，包括與培養(yǎng)基生長直接相關(guān)的各種因素，才能有助于研究者更好地理解這些因素并進一步開發(fā)培養(yǎng)未培養(yǎng)微生物的方法。最近的一些研究探究了不同成分和濃度的培養(yǎng)基對于培養(yǎng)未培養(yǎng)微生物的影響。Li等應(yīng)用體外培養(yǎng)方法，在厭氧培養(yǎng)基中添加十八碳烯酸(TVA)至不同終濃度(0、30、40、50、60μg/mL)，接種瘤胃微生物后進行連續(xù)和傳代培養(yǎng)，傳代富集培養(yǎng)時，用DGGE監(jiān)測菌群變化，發(fā)現(xiàn)當傳至第4代，TVA氫化菌群的數(shù)量增加最顯著，對差異條帶的測序結(jié)果表明這些細菌大多屬于未培養(yǎng)的瘤胃細菌。Davis等和Sait等參考系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)菌種，通過修飾和富集培養(yǎng)基成功地分離出之前未培養(yǎng)的微生物。微生物學家通過在培養(yǎng)基中加入氫氧化鐵和錳氧化物作為電子受體，實現(xiàn)了微生物的高效培養(yǎng)，例如變形菌門、擬桿菌門、梭桿菌門、放線菌門、厚壁菌門、酸桿菌門、疣微菌門和鹽單胞菌門。Kashefi等根據(jù)嗜高熱微生物利用Fe(III)作為終端電子受體這一高度保守的特性，在培養(yǎng)基中添加非常微量的Fe(III)氧化物。該方法的前提是對微生物特性有一定的了解。Santini等從Aodaliya金礦中分出以亞砷酸為電子供體，氧為受體，以CO2為唯一碳源的優(yōu)能自養(yǎng)菌(NT-26)，16SrRNA基因序列分析表明，NT-26屬于α-Proteobacteria土壤桿菌的一個根瘤菌分支，可能是一新種。一些研究關(guān)注甲烷厭氧氧化對于硫酸鹽或硝酸鹽的還原作用。這些方法需要精確的培養(yǎng)基，其中包括碳氫化合物能量來源和硝酸鹽，鐵和硫酸鹽作為電子受體。

對來自北海的樣本進行的研究顯示，碳源的品質(zhì)是決定培養(yǎng)效率的關(guān)鍵因素。包含不同碳源和復雜化合物的培養(yǎng)基所培養(yǎng)出的微生物數(shù)量和多樣性比只含有一種碳源的培養(yǎng)基更高。相反地，許多自養(yǎng)微生物不能在只有一種固定碳源的培養(yǎng)基中生長。目前，通過使用低底物濃度的培養(yǎng)策略，針對未培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)已經(jīng)取得一些成效。放線菌門、酸桿菌門、變形菌門和疣微菌門利用低營養(yǎng)培養(yǎng)基和增加培養(yǎng)代數(shù)進而被成功地培養(yǎng)。改善培養(yǎng)條件(如營養(yǎng)水平，氧氣濃度，腐殖酸的添加和信號分子)也增加了一些新型微生物。最近，科學家創(chuàng)新地開發(fā)出高選擇性培養(yǎng)基，最大的優(yōu)勢是該培養(yǎng)基對特定的微生物具有高選擇性。這種方法被用來開發(fā)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)水稻細菌性谷枯病菌、燕麥食酸菌、果膠桿菌、青枯雷爾氏菌和野油菜黃單胞菌(表2)。在培養(yǎng)基中添加腐殖酸、信號分子、處理活性氧的酶類或移除某些抑制因子提高未培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)性。一些微生物學家證實吉蘭糖膠對于未培養(yǎng)的微生物的培養(yǎng)和分離是有效的，因為它的平板成分比瓊脂要更清楚，因此更容易找到非常細微的菌落。吉蘭糖膠也可能增強受瓊脂抑制的微生物的生長。吉蘭糖膠培養(yǎng)基上的菌落計數(shù)是瓊脂培養(yǎng)基的10倍。生長在吉蘭糖膠培養(yǎng)基上大約60%的微生物被認為是新的，在同樣的條件下，新分離得到的微生物中的一半在瓊脂培養(yǎng)基上不能形成菌落。

2.2群體培養(yǎng)

2.2.1共培養(yǎng)

在自然環(huán)境的微生物區(qū)系中，微生物間的相互作用對于群體生存是至關(guān)重要的，但是由于內(nèi)在的復雜性和實驗室培養(yǎng)的困難性，這些相互作用間的確切機制仍然是不清楚的。傳統(tǒng)的以培養(yǎng)為導向的研究并不能解釋由信號分子介導的相互作用，這些信號分子嚴重地限制了對于未培養(yǎng)互養(yǎng)微生物的研究。因為微生物總是會在一個群體中與其他微生物建立一種關(guān)系，并且這些相互作用一方能夠競爭有限的資源，另一方面也會通過代謝物和信號分子的交流進行合作。微生物之間相互交流的典型的例子比如生物膜和多細胞培養(yǎng)裝置，都可以實施單個物種培養(yǎng)不可能實現(xiàn)的多功能培養(yǎng)。例如，混合細胞組合能夠完成多級纖維素降解，并且產(chǎn)物中間體能被作為碳源進行利用。Park等開發(fā)了一種簡易的微液滴裝置用于高效培養(yǎng)互養(yǎng)微生物群體，同時來證明其在微生物間協(xié)同共生中的效果。微液滴裝置是單分散液滴中封裝和培養(yǎng)微生物群體中的小單元。如果液滴將有互作關(guān)系的微生物局部化，那么這些微生物將能夠分裂生長(圖1A)。傾斜的T形連接用于液滴的產(chǎn)生，反應(yīng)室用于保留液滴進而進行培養(yǎng)(圖1B，C)，這個傾斜的T形連接能夠產(chǎn)生均勻分散的液滴，在入口的壓力下，至少1400個液滴能夠被非常緊密地包裹在10mm×5mm的反應(yīng)室內(nèi)(圖1D)。

共培養(yǎng)也是一種培養(yǎng)兼性或互養(yǎng)微生物的有效方法。到目前為止，兩種成功的例子已經(jīng)被報道：(1)一種利用透析膜反應(yīng)器的群體培養(yǎng)方法已經(jīng)成功地從厭氧淤泥中培養(yǎng)出厭氧嗜熱的降解谷氨酸的微生物。(2)另一種利用在厭氧和需氧交替的間歇反應(yīng)器中的群體培養(yǎng)成功富集到混合微生物。新的微生物通過與耗氫型微生物共培養(yǎng)或使用適合生長的純培養(yǎng)基質(zhì)得以成功地鑒定。另外，在很多情況下，不同技術(shù)結(jié)合使用已經(jīng)取得了成功。例如，通過將適合生長的環(huán)境條件與輔助菌株結(jié)合使用，Nichols等培養(yǎng)出一種新的嗜冷桿菌屬。輔助菌株提供了必要的生長因子，這些生長因子對于使用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)未培養(yǎng)菌株是重要的發(fā)現(xiàn)。其他的研究者已經(jīng)使用非共生的變形蟲作為一種工具來分離環(huán)境樣品中(包括土壤)新的胞內(nèi)微生物[40]。

圖1用于共培養(yǎng)的微流體裝置

注：A：利用共培養(yǎng)空間檢測微生物間的共生關(guān)系；B：微流體裝置原理圖；C：微流體裝置實物圖；D：微流體裝置內(nèi)液滴形成反應(yīng)室.

2.2.2原位培養(yǎng)

模擬目標微生物的自然環(huán)境進行原位培養(yǎng)和分離是目前研究者的一個基本策略。Kaeberlein等模擬海洋微生物自然生長的環(huán)境，設(shè)計出名為擴散生長盒(Diffusiongrowthchamber)的自制培養(yǎng)儀器(圖2)，使用這種儀器來分離培養(yǎng)微生物。該擴散盒由一個環(huán)狀的不銹鋼墊圈和兩側(cè)膠連孔徑為0.03μm的濾膜組成，濾膜既允許有益的小分子代謝物質(zhì)和圈內(nèi)外微生物產(chǎn)生的活性物質(zhì)透過膜自由進出小室，化學物質(zhì)在盒內(nèi)和環(huán)境之間進行交流又不能讓微生物細胞通過造成逃逸，因此使高密度培養(yǎng)成為可能。擴散盒內(nèi)加入被分離的環(huán)境樣品即海洋微生物樣品與瓊脂的混合物，封閉后置于模擬采樣點環(huán)境條件的玻璃缸中進行培養(yǎng)，并不斷注入新鮮的海水循環(huán)流動。1周后，培養(yǎng)基上產(chǎn)生大量形態(tài)各異的微型菌落，數(shù)目高達接種微生物的40%，微菌落中多數(shù)為混合培養(yǎng)，需再次分離以獲得純種。最后從海水中分離到一株新的菌株。不同類型膜基系統(tǒng)已經(jīng)被開發(fā)出來在自然環(huán)境中直接生長微生物群體。來自土壤、海洋或活性污泥中的未培養(yǎng)微生物被培養(yǎng)在擴散生長盒中。據(jù)此得出了這種假設(shè)：在擴散生長盒里環(huán)境中原位培養(yǎng)的原核生物一方面進行充分的菌株富集為了隨后的分離并移入傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)基，另一方面在試管培養(yǎng)條件中使菌株適應(yīng)抑制性的條件。有趣的是，很多緩慢生長的菌落應(yīng)用該方法也可以被成功培養(yǎng)。研究者已經(jīng)在模擬的自然環(huán)境中通過使用擴散生長盒測試了未培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)性并取得了成功的結(jié)果。在此基礎(chǔ)上，科研人員開發(fā)了一種新的高通量平臺用于大量培養(yǎng)和分離環(huán)境中的未培養(yǎng)微生物，這種平臺被稱為分離芯片(Isolationchip，Ichip)。Ichip由數(shù)百個微型擴散室組成，每個室可接種單個的環(huán)境細菌。通過這種方法，使研究者研究那些不能人工培養(yǎng)微生物成為可能。這種方法的合理性在于，可以讓一些自然生長因子通過擴散進入到培養(yǎng)室內(nèi)，從而有助于培養(yǎng)室內(nèi)的細菌生長。結(jié)果表明，通過這種方法分離到的細菌大大超過了傳統(tǒng)分離方法得到的細菌。Nichols等設(shè)計并測試一種分離芯片(Ichip)(圖3)，先把中央平板浸到目標細胞懸液中進行培養(yǎng)，進而轉(zhuǎn)到瓊脂培養(yǎng)基中，等培養(yǎng)基冷卻后固定下來，平板兩邊附上薄膜經(jīng)過擠壓彼此分開(圖3)。通過這種芯片分離得到約40%海水微生物種類和50%土壤微生物種類，其中海水樣品中具有62個(28.3%)、土壤樣具有86個(28.7%)純培養(yǎng)微生物的16SrRNA基因相似性小于95%。這個方法可以用于大量且多樣性高的微生物的分離培養(yǎng)。Jung等開發(fā)了一種新技術(shù)，采用I-tip方法使微生物和自然界的化學物質(zhì)混合稀釋進而能夠讓微生物在自然環(huán)境中利用這些物質(zhì)生長，利用原位培養(yǎng)手段培養(yǎng)出更具多樣性的微生物群體，縮小了可培養(yǎng)和未培養(yǎng)微生物間的距離。

圖2擴散生長盒原位培養(yǎng)環(huán)境微生物示意圖

注：A：擴散室是由兩個0.03μm的聚碳酸酯膜及夾在二者之間的墊圈組成的；B：生長擴散室被培養(yǎng)在海洋沉積物的表面.

圖3分離芯片原位培養(yǎng)微生物的示意圖

注：A：將有多孔的中央平板浸到目標細胞懸液中進而捕獲單細胞；多孔中央平板的局部放大圖；分離芯片裝配：上下兩邊帶有多孔的中央平板通過薄膜擠壓中間的平板；B：螺絲用來密封多孔內(nèi)的細胞；C：分離芯片裝配：上下兩邊帶有多孔的中央平板通過薄膜擠壓中間的平板，螺絲用來密封多孔內(nèi)的細胞.

2.3細胞捕獲

2.3.1單細胞捕獲分離

單細胞捕獲分離技術(shù)是指利用拉曼光譜儀等設(shè)備對特征細胞進行分離，進而對其功能進行研究。Wang等通過優(yōu)化光路、提高激光強度等方式顯著提高了單細胞拉曼光譜的采集速度，首次將微生物細胞拉曼圖譜獲取時間降低到毫秒級，為高通量單細胞拉曼分選奠定了基礎(chǔ)。同時，結(jié)合激光誘導向前轉(zhuǎn)移(LIFT)原理，發(fā)明了拉曼激活細胞彈射(Raman-activatedcellejection，RACE)技術(shù)，可用于將特定拉曼表型的單細胞從復雜微生物群落中分離，從而獲取其基因組信息。研究人員一直是通過利用如宏基因組學研究等方法來發(fā)現(xiàn)一些生物體，探討生活在環(huán)境中的微生物群體，它們通常難以或不可能在實驗室中進行培養(yǎng)。然而利用單細胞測序，科學家將來自單個細胞的DNA擴增10億倍，破譯了它的基因組，從而為研究從前未知的“微生物暗物質(zhì)”開辟了一條新途徑。美國能源部下屬聯(lián)合基因組研究所的譚佳·沃克領(lǐng)導的研究團隊選擇了201種微生物和古生細菌的細胞，并閱讀了其部分基因組(從10%到90%不等，取決于不同細胞)。這些微生物來源于9種不同的生存環(huán)境，包括海底熱水流火山口以及地下金礦等，沒有一種曾被測序或在實驗室內(nèi)培養(yǎng)過。研究人員通過選擇高度多樣化的微生物，測定了部分的基因組序列(范圍從低于10%到高于90%，這取決于細胞)，來嘗試探索這些暗物質(zhì)(圖4)。通過序列闡明了這些微生物之間，以及與其他物種之間的關(guān)系。在新數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，作者提出了對古生菌域和細菌域的分類修正，包括提議將古菌重新歸入三個“超級門”。通過應(yīng)用單細胞捕獲分離技術(shù)能夠直接分離單細胞，進而研究細菌多樣性。

2.3.2熒光激活細胞分離技術(shù)

流式細胞術(shù)是一種熒光依賴的細胞表征技術(shù)，也被廣泛用來進行微生物細胞的分離。單個細胞在強光源(激光或激光二極管)前面通過時，可以利用單個細胞的特性(如大小、形狀、細胞熒光信號等)快速分析整個細胞群體。當把特異的熒光信號(如FACS)與細胞分選結(jié)合起來后就可以對來自復雜環(huán)境樣品的大量細胞進行快速分析，如含有FISH探針的個體就能夠從這個群體中被分揀出來。Ozawa等利用流式細胞熒光分選技術(shù)(FACS)從水樣中檢測和分離低濃度的微生物，有31種致病菌被分離出來[48]。Podar等對不可培養(yǎng)的TM7生物門的細菌群體進行研究。他們利用原位熒光雜交技術(shù)和流式細胞術(shù)結(jié)合的方式對土壤樣品中的單一細胞以及小批量細胞(5?100個)進行分離，接著對一些屬于TM7門的細菌基因組片段進行擴增測序，發(fā)現(xiàn)采用該方法可以從土壤群落中篩選到低頻率(0.02%)的靶細胞，表明該方法可以用來識別和分離群落中“無法看到的”稀有物種的代表性微生物[49]。

圖4單細胞測序工作流程

注：A：每個細胞裂解后進行基因組擴增產(chǎn)生3300個成功的擴增序列.大部分屬于新譜系的單一擴增基因組被用于基因組測序和草圖組裝，最終得到201個基因組草圖.

Kvist等從環(huán)境樣本提取細胞后，使用Cy3標記的探針進行熒光原位雜交。用顯微操縱器將標記有明亮螢光信號的單細胞分離，并用單個分離的細胞作為多重置換擴增的模板(圖5)。多重置換擴增的產(chǎn)物隨后用于16SrRNA基因序列分析。結(jié)果顯示>99%16SrRNA基因與土壤泉古菌SCA1170分支具有同源性。用此方法分離了一株土壤泉古菌。但是應(yīng)用該方法有兩個限制因素，一是存在序列偏差，盡管各種改進的策略正在逐步減少這些缺陷，高覆蓋率、高保真性及高特異性的擴增仍然是亟待解決的問題；二是由于核糖體RNA很強的進化保守性，從而導致以其為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)生分析的分辨率比較低，如16SrRNA基因就無法完整地表征菌株(基因型)的特性。因此，我們必須進一步改進這種技術(shù)的操作過程，以尋求更為有效的方法來減少非靶向生物體及外源DNA的污染等情況的發(fā)生。另外，對測序得到的大數(shù)據(jù)的分析也是一個重大的挑戰(zhàn)。

圖5利用熒光原位雜交進行單細胞分離和擴增的原理圖

注：A：探測到特定的目標單細胞后被顯微操縱器分離，其基因組作為模板利用多重置換擴增技術(shù)用于基因組擴增.

2.4高通量分離培養(yǎng)

2.4.1培養(yǎng)組學

培養(yǎng)組學是一種通過增加培養(yǎng)條件來檢測細菌多樣性的高通量方法。首先利用血液培養(yǎng)基富集，隨后在瓊脂培養(yǎng)基中進一步培養(yǎng)。在這一過程中，確認了3種成分是必需的：在血液培養(yǎng)瓶中預(yù)培養(yǎng)(分離到56%的新菌種)、瘤胃液的添加(分離到40%新菌種)以及羊血的添加(分離到25%的新菌種)。Lagier等借助微生物培養(yǎng)組學(Culturomics)，綜合多重培養(yǎng)條件、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)及16SrRNA基因測序技術(shù)，極大地改善了培養(yǎng)條件，增加了可培養(yǎng)微生物的數(shù)量。同時，選擇最佳的培養(yǎng)條件來增加研究樣本的數(shù)量和應(yīng)用新的實驗方法(新鮮樣本的接種；小菌落的檢測和變形菌門、微需氧菌和嗜鹽性的原核生物)來解決之前研究存在的不足。通過這種方法，鑒定出1057個原核生物物種，其中531種屬于人體腸道菌群；利用培養(yǎng)組學，首次分離得到的腸道微生物種類至少增加了一倍(圖6)。

圖6培養(yǎng)組學工作的原理圖

注：A：培養(yǎng)組學是一項綜合多重培養(yǎng)條件、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)及16SrRNA基因測序技術(shù).

2.4.2微液滴培養(yǎng)法

Zengler等設(shè)計了一個非常精妙的方法，將細胞包埋在凝膠微滴板中，在低營養(yǎng)的流動培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，再用流動血細胞計數(shù)法檢測微滴板上有多少個微克隆(圖7)。這是一個開放流動的系統(tǒng)，微生物間的代謝產(chǎn)物及信號分子可在凝膠空隙中進行擴散而被其他菌利用。這與自然環(huán)境有很多的相似之處，因而新培養(yǎng)出來的微生物種類也大大增加。這種方法可用于土壤和海水等環(huán)境，并且能夠在每個環(huán)境樣本中分離得到10000多個細菌和真菌。Jiang等借助微液滴平板劃線技術(shù)研究微生物的多樣性。從多環(huán)芳烴富集的土壤微生物群落中分離培養(yǎng)單細胞，得到4個分枝桿菌分離株和1種之前未知的降解熒蒽的芽球菌屬。該方法與之前的微液滴方法相比，不需要昂貴的自動化設(shè)備來產(chǎn)生微液滴，并且操作簡單易行。此外，通過組合油相載體，這個方法能夠被應(yīng)用到其他方面，例如將油脂、石油和能溶于油相的疏水性底物，例如不溶于水的除草劑、殺蟲劑和其他疏水環(huán)境污染物結(jié)合，能夠分離和識別具有生物修復和生物轉(zhuǎn)化的環(huán)境微生物。美國東北大學的工程師EdgarGoluch和生物學家SlavaEpstein開發(fā)出一種微型納米設(shè)備，用來從物種混合物中捕獲單個細菌細胞，產(chǎn)生這些細胞的純培養(yǎng)可以解決微生物培養(yǎng)中的局限性。這種新型設(shè)備可以使單一的細菌細胞通過通道進入到包含有細菌“食物”的小室中，而細菌細胞進入的顯微通道，僅比細菌細胞稍窄一些。因此，當進入一個細菌細胞后，就可以阻斷其余細胞的進入。在小室中細菌的細胞就可以開始增殖，當其增殖到純種樣本并且充滿整個箱體后，研究者就會對其進行收集和鑒定。該設(shè)備的優(yōu)勢是養(yǎng)料室的收縮尺寸和營養(yǎng)成分可以動態(tài)調(diào)整，進而增加捕獲細胞的多樣性，或者優(yōu)化特定性狀物種的分離。

圖7基于單細胞包埋在凝膠微滴板中的高通量培養(yǎng)方法流程圖

注：A：將細胞包埋在凝膠微滴板中，在低營養(yǎng)的流動培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，再用流動血細胞計數(shù)法檢測微滴板上有多少個微克隆.

2.4.3生物反應(yīng)器培養(yǎng)法

Amanullah等采用目前一種新型的自動化小規(guī)模生物反應(yīng)器，通過構(gòu)建適宜的pH、溶解氧和葡萄糖的條件進行流加培養(yǎng)，能夠成功地模擬搖瓶和生物反應(yīng)培養(yǎng)條件，相較于傳統(tǒng)方法可以實現(xiàn)更高濃度的活細胞培養(yǎng)，濃度至少可達12×106cells/mL。為了能夠從貧營養(yǎng)海洋生態(tài)系統(tǒng)中培養(yǎng)未培養(yǎng)微生物，Connon等利用高通量培養(yǎng)方法在低營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行分離培養(yǎng)。研究人員使用將微量滴定板和新開發(fā)的細胞芯片相結(jié)合的方法，檢測限能達到103cells/mL。從近岸海水中收集的樣本中，至少14%的細胞利用這個方法能夠被培養(yǎng)。與傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法相比，培養(yǎng)的數(shù)量要高14?1400倍。在培養(yǎng)出的微生物中，4種獨特的細胞譜系屬于之前未培養(yǎng)的海洋厚壁菌門。這個方法在培養(yǎng)已知的海洋克隆文庫中未培養(yǎng)的海洋浮游微生物是有效的。

3未培養(yǎng)微生物應(yīng)用前景

未培養(yǎng)微生物在自然環(huán)境微生物群落中占有非常高的百分比(約99%)，無論是其物種類群，還是新陳代謝途徑、生理生化反應(yīng)、產(chǎn)物等方面都存在著不同程度的新穎性和豐富的多樣性，因而其中勢必蘊含著巨大的生物資源，具有非?？捎^的應(yīng)用前景。首先，在生物降解方面，廈門大學微生物研究所的實驗室從在生態(tài)環(huán)境中尋找未培養(yǎng)微生物及其降解基因的角度出發(fā)，應(yīng)用宏基因組技術(shù)構(gòu)建文庫，在尋找抑制赤潮藻類的相關(guān)基因及PAHs高效降解基因已進行了大量研究，已取得初步研究成果，期望在未培養(yǎng)微生物中尋找高效功能基因并應(yīng)用于污染的生態(tài)環(huán)境治理。其次，在藥物篩選方面，Ouyang利用瓊脂糖凝膠包埋法從中國南海的多種海綿中分離得到超過400kb大小的細菌DNA片段，并用獲得的大片段DNA構(gòu)建了海綿Halichondriasp.的BAC文庫。此外，在酶類資源發(fā)掘方面，多位科學家利用功能性篩選可以快速地從多個克隆子中鑒定出全長基因，并由此獲得這些功能基因的產(chǎn)物，為工業(yè)、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)提供一些新的天然活性物質(zhì)如各種酶類及一些次生代謝產(chǎn)物等，包括4-羥基丁酸脫氫酶、N-?；野彼岷铣擅?、幾丁質(zhì)酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、酯酶等。

4總結(jié)與展望

目前為止，因為單純的基因測序無法解答微生物群落功能和代謝，因此，分離未培養(yǎng)微生物的方法越來越受微生物學者關(guān)注。然而，傳統(tǒng)的方法存在分離效率低、操作復雜、設(shè)備昂貴或缺乏群體交互作用等缺點，難以分離特定功能微生物(群)。因此，本文綜述了改良培養(yǎng)基、共培養(yǎng)、原位培養(yǎng)、單細胞捕獲分離、熒光激活細胞分離技術(shù)、培養(yǎng)組學、微液滴培養(yǎng)法等新方法，并且提出必要時可幾種培養(yǎng)手段相結(jié)合，優(yōu)勢互補，從多個角度對未培養(yǎng)微生物進行分離培養(yǎng)。同時，我們要發(fā)掘未培養(yǎng)微生物豐富的基因資源，發(fā)現(xiàn)新的酶類和化合物。基于以上研究現(xiàn)狀，筆者認為，未來還應(yīng)在以下幾個方面加強研究：

（1）筆者實驗室從事瘤胃微生物分離培養(yǎng)研究工作多年，在厭氧滾管技術(shù)和調(diào)整培養(yǎng)基等方面均進行了很多探索，目前通過富集培養(yǎng)已成功從奶牛瘤胃中分離得到具有TVA氫化能力的微生物菌株一株；從瘤胃壁上分離得到地衣芽孢桿菌和奇異變形菌，從瘤胃液中分離獲得白色瘤胃球菌、溶糊精琥珀酸弧菌和布氏密螺旋體，總共5種尿素分解菌，為進一步認識瘤胃微生物提供理論依據(jù)和方法基礎(chǔ)。同時，我們實驗室發(fā)明了一種基于短序列的引物設(shè)計來定量差異細菌的方法，并成功運用了基于短的16SrRNA基因序列設(shè)計的引物定量目標未培養(yǎng)細菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與飼喂混合粗飼料的奶牛瘤胃微生物相比，飼喂秸稈粗飼料的奶牛瘤胃中顯著減少的未培養(yǎng)細菌R-UB來源于Succinivibrionaceae，有助于我們通過針對性地調(diào)控瘤胃微生物來更好地利用秸稈粗飼料資源。此外，我們利用自主研發(fā)的人工瘤胃模擬系統(tǒng)，以尿素和脲酶抑制劑(乙酰氧肟酸)分別作為尿素分解菌的激活劑和抑制劑，通過高通量測序技術(shù)研究細菌16SrRNA基因變化，揭示瘤胃優(yōu)勢尿素分解菌群。最終揭示了瘤胃優(yōu)勢尿素分解菌：Pseudomonas、Streptococcus、Haemophilus、Bacillus、Neisseria、Actinomyces和Succinivibrionaceae[60]。該研究解決了純培養(yǎng)難題，這對于胃腸道重要功能菌群的鑒定提供了新的研究思路。另外，奶牛瘤胃尿素分解菌群的鑒定，為調(diào)控瘤胃尿素代謝和提高尿素氮利用率提供了新的調(diào)控靶標。但是一方面由于我們?nèi)匀蝗狈ξ⑸锏亩鄻有?、生存環(huán)境以及在生物進化中地位的認識，無法設(shè)計微生物生長的原位環(huán)境實現(xiàn)群體培養(yǎng)，導致依賴其他微生物的代謝活動或者其他環(huán)境條件中的微生物不能生長。另一方面，緩慢生長的或稀有的微生物經(jīng)常在培養(yǎng)和測序的過程中被豐度相對高的微生物所掩蓋。因此還需繼續(xù)加強對微生物生理環(huán)境的分析研究，解析影響未培養(yǎng)微生物不能培養(yǎng)的關(guān)鍵營養(yǎng)因子。

（2）雖然以共培養(yǎng)、原位培養(yǎng)、單細胞捕獲分離、熒光激活細胞分離技術(shù)、培養(yǎng)組學、微液滴培養(yǎng)法等為代表的分離培養(yǎng)技術(shù)近年來迅速發(fā)展，但一些常規(guī)方法(如傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法、厭氧滾管技術(shù)、改良培養(yǎng)基等)也不能完全摒棄。應(yīng)該將多種技術(shù)相結(jié)合，為探究環(huán)境中微生物分布和多樣性，解析不同環(huán)境條件下微生物生態(tài)功能，挖掘環(huán)境中未培養(yǎng)微生物，更新和完善微生物數(shù)據(jù)庫等提供新的方法學支持。

（3）必須全面理解微生物生理適應(yīng)性與群體行為，發(fā)展和革新培養(yǎng)技術(shù)，改變微生物培養(yǎng)方式，設(shè)計盡可能接近微生物生活的自然環(huán)境，培養(yǎng)出更多的“不可培養(yǎng)微生物”，推動來源于未培養(yǎng)微生物的新基因、新活性物質(zhì)和天然產(chǎn)物等資源的挖掘利用。

文獻來源微生物學通報DOI:10.13344/j.microbiol.china.170356作者：邢磊趙圣國（轉(zhuǎn)載僅供參考學習及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請聯(lián)系刪除）